九、猪细小病毒病

猪细小病毒病是由猪细小病毒引起的猪的一种繁殖障碍性传染病。其特征是受感染母猪，特别是初产母猪产死胎、畸形胎、木乃伊胎，偶有流产；公猪繁殖力低下，新生畜全身性疾病。

该病最早是在1967年发现于英国，目前世界各个国家几乎均有流行报道，其所致的繁殖障碍是世界养猪业面临的问题，一旦侵入猪群，发病率非常高。我国自20世纪80年代从各地相继分离到猪细小病毒后，经血清学调查猪群中该病的阳性率达85%以上，给各地养猪业造成了相当大的损失。

（一）病毒特征

猪细小病毒（Porcine nanovirus，PPV）属于细小病毒科（Parvoviridae）细小病毒亚科（Parovirus）。病毒粒子呈圆形或六角形，20面体立体对称，核酸为单股DNA，无囊膜，直径18～26nm，有32个壳粒，壳粒直径为14～17nm，对氯仿、乙醚及热（56℃30min）和酸（pH3，60min）均稳定。

培养病毒常用猪源性细胞，包括原代细胞（如猪肾、猪睾丸等）和传代细胞（如PK-15、IBRS-2、ST细胞等），在细胞长至一半时或在制备细胞悬液时接种病毒（同步接种），病毒可在细胞中产生核内包涵体，于接种后2～5d，适应了细胞培养的病毒可使受感染细胞变圆、固缩和裂解等，即产生细胞病变（CPE），而初次分离时可能无细胞病变或病变不典型，需要连续几代后才能观察到，但无论是初次分离或进行适应性毒株传代，都可用免疫荧光技术检测胞浆中的病毒抗原。此外，应注意的问题是原代细胞和传代细胞以及培养这些细胞所用的牛血清都有被该病毒污染的可能性，在进行细胞培养物接毒之前应对其进行检测。

PPV毒力有强弱之分，但至今只有一个血清型，PPV具有血凝活性，能凝集人、猴、豚鼠、猫及小鼠等多种动物的红细胞。但温度、pH、红细胞种类以及供血动物的遗传特性和年龄等对血凝反应都有一定影响。一般认为pH接近中性，使用豚鼠红细胞时可获得较好的结果。

本病毒在淋巴结、扁桃体、胸腺、脾、肺、唾液腺等器官复制，外周血淋巴细胞（如T细胞、B细胞及N细胞）中也能很好地复制，并刺激这些细胞增殖，单核细胞及巨噬细胞吞噬病毒后被感染并被破坏。与其他细小病毒相比，猪细小病毒更易引致慢性排毒的持续性感染。

PPV对环境的抵抗力极强，能耐受56℃48h、70℃2h处理仍不被杀灭，在80℃经5min才能使其灭活。急性感染猪分泌物和排泄物的病毒可在污染圈舍中存活9个月之久。在pH9的甘油缓冲盐水中或在－20℃以下保存1年以上毒力不会下降。该病毒耐酸范围大，pH3～9时，经90min仍稳定；pH2时，90min才能将其灭活。短时间胰酶处理对病毒悬液感染性不仅没有影响，反而能提高其感染效价。0.5%漂白粉液、2%氢氧化钠液、0.3%次氯酸钠5min可杀死病毒。

（二）临床症状

仔猪和母猪感染本病后，通常都呈亚临诊症状，但在体内许多器官和组织中都能发现该病毒。PPV感染主要的（通常也是唯一的）临诊表现为母猪的繁殖障碍，但取决于发生病毒感染母猪的妊娠时期。如果感染发生在怀孕早期，可造成胚胎死亡，母猪可能再度发情，也可能既不发情也不产仔，也可能每胎只产出几个仔猪或产的胎儿大部分都已木乃伊化；如果感染发生在怀孕中期或后期，胚胎死亡后胎水被母体重吸收，母猪腹围逐渐缩小，最后可出现木乃伊胎、死胎或流产等（图1-55）。妊娠30～50d感染主要产木乃伊胎，妊娠50～60d感染主要产死胎，至于木乃伊化程度，则与胎儿感染死亡日龄有关。如早期死亡，则产生小的、黑色的、枯僵样木乃伊；如晚期死亡，则产生大的木乃伊胎；死亡愈晚，木乃伊化的程度愈低。怀孕70d后感染，母猪多能正常生产，但产出的仔猪带毒，有的甚至终身带毒而成为重要的传染源。细小病毒感染引起繁殖障碍的其他表现还有母猪发情不正常、返情率明显升高、新生仔猪死亡、产出弱仔、妊娠期和产仔间隔延长等现象。病毒感染对公猪的受精率或性欲没有明显的影响。此外，本病还可引起母猪发情不正常，久配不育。

（三）病理变化

怀孕母猪感染后，缺乏特异性的眼观病变，仅见母猪轻度子宫内膜炎，胎盘部分钙化，胎儿在子宫内有被溶解吸收的现象。受感染的胎儿可见不同程度的发育障碍和生长不良，胎儿充血、水肿、出血、胸腹腔有淡红色或淡黄色渗出液、脱水（木乃伊胎）及坏死等病变。

组织学病变为母猪的妊娠黄体萎缩，子宫上皮组织和固有层有局灶性或弥散性单核细胞浸润。死亡胎儿多种组织和器官有广泛的细胞坏死、炎症和核内包函体。其特征性组织病变是大脑灰质、白质和软脑膜出现非化脓性脑膜脑炎的变化，内部有以外膜细胞、组织细胞和浆细胞形成的血管套。

（四）流行病学特征

易感动物：猪是唯一的易感动物。不同年龄、品种、性别的家猪和野猪均可感染。据报道，在牛、羊、猫、小鼠和大鼠的血清中也存在特异性抗体，来自病猪场的鼠类，其抗体阳性率高于阴性猪场的鼠类。

传染源：感染的公猪、母猪和持续性感染的外表健康猪、感染或死亡的胎儿、木乃伊胎，或产出的仔猪都带毒，是本病的主要传染源。污染的猪舍是病毒的贮存场所。感染猪排毒可达数月，病毒可通过多种途径排出体外。感染母猪由阴道分泌物、粪、尿及其他分泌物排毒，公猪通过精液长时间排毒。在子宫内感染的仔猪可能存活作为免疫耐受的带毒者。

传播途径：主要通过直接接触或接触被污染的饲料、饮水、用具、环境等经消化道传染，也可经配种传播，妊娠母猪可通过胎盘传给胎儿。猪在出生前后最常见的感染途径分别是胎盘和口鼻，通过呼吸道感染也是非常重要的途径。

流行因素和形式：本病呈地方流行性或散发，多发生于产仔旺季，以头胎妊娠母猪发生流产和产死胎的较多。PPV在世界各地的猪群中广泛存在，几乎没有母猪免于感染，PPV一旦传入猪场则连续几年不断地出现母猪繁殖障碍。因此，大部分小母猪怀孕前已受到自然感染，而产生了主动免疫，甚至可能终生免疫。血清学阴性的怀孕母猪群一旦感染病毒，损失惨重。

（五）预防及治疗

本病目前尚无有效的治疗方法，应在免疫预防的基础上，采取综合性防控措施。

免疫预防：由于PPV血清型单一及其高免疫原性，因此，疫苗接种已成为控制PPV感染的一种行之有效的方法。目前常用的疫苗主要有灭活疫苗和弱毒疫苗。初产母猪配种前2～3周肌内接种1头份，种公猪于8月首次免疫注射，以后每年注射1次，每次肌内注射1头份，但应注意免疫母猪哺乳的仔猪从初乳中可获得高滴度的母源抗体，经过3～6个月才能降低到血凝抑制试验检测不出的程度，这种被动性抗体可以干扰猪群主动免疫力的产生，因此免疫接种1个月后最好进行血清学检测，以评价免疫的效果。

综合防控：严防传入，坚持自繁自养的原则，如果必须引进种猪，应从未发生过本病的猪场引进。引进种猪后应隔离饲养半个月，经过两次血清学检查，HI效价在1∶256以下或为阴性时，才合群饲养。

加强种公猪检疫，种公猪血清学检查阴性，方可作为种用。

在本病流行地区，将母猪配种时间推迟到9月龄后，因为此时大多数母猪已建立起主动免疫，若早于9月龄时配种，需进行HI检查，只有具有高滴度的抗体时才能进行配种。

疫情处理：群发病后应首先隔离发病动物，划定疫区，制定扑灭措施。对其排泄物、分泌物和圈含、环境、用具等进行彻底消毒，扑杀发病母猪、仔猪，尸体无害化处理。发病猪群，其流产胎儿中的幸存者或木乃伊同窝的幸存者，不能留作种用。由于猪细小病毒对外界物理和化学因素的抵抗力较强，消毒时可选用福尔马林、氨水和氧化剂类消毒剂等。

（六）实验室检测

猪细小病毒间接ELISA抗体检测

依据标准：NY/T 2840—2015。

1.试剂

（1）猪细小病毒VP2重组蛋白（re-VP2）　克隆猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因，用pET-32a表达载体进行原核表达，亲和层析法纯化重组蛋白。获得的重组蛋白浓度应≥1mg/ml，纯度应95%，具体过程见附录A。

（2）阳性血清对照　选取5月龄健康猪2头，用猪细小病毒疫苗按规定剂量进行免疫，间隔3周免疫2次，第二次免疫1个月后开始采血分离血清，用血凝抑制试验测定其抗体效价，当抗体的血凝抑制效价达到1∶1024时采血分离血清，将血凝抑制效价为1∶1024的阳性血清用样品稀释液（参见附录B）进行1∶50稀释，即为阳性血清对照。

（3）阴性血清对照　采集无母源抗体、未免疫猪细小病毒疫苗的健康猪血清，经血凝抑制试验检测，结果为猪细小病毒抗体阴性，用样品稀释液（参见附录B）进行1∶50稀释，即为阴性血清对照。

（4）包被液、洗涤液、封闭液、样品稀释液、标抗体稀释液、底物显色液、终止液配制方法见附录B。

（5）器材和设备　一次性注射器、恒温培养箱、振荡混匀仪、移液器（200μl、1000μl）、多道移液器（200μl）、酶标板、酶联免疫检测仪等。

2.血清样品的处理

（1）血清样品的采集和处理　静脉采血，每头猪不少于2ml。血液凝固后分离血清，4000r/min离心10min，用移液器吸出上层血清。

（2）血清样品的储存和运输　血清样品置－20℃以下冷冻保存。运输时确保低温运送，并及时送达，以防血清样品腐败。按照中华人民共和国农业部〔2003〕第302号公告的规定进行样品的生物安全标识。

3.间接ELSA抗体检测操作方法

（1）包被抗原　以纯化的猪细小病毒VP2重组蛋白（re-VP2）作为包被用抗原，将重组蛋白re-VP2用包被液稀释至3μg/ml，每孔加入100μl（每孔抗原包被量为300ng），37℃包被2h，用洗涤液洗板3次，每次5min。

（2）封闭　每孔加入200μl封闭液，37℃封闭2h，洗板同（1）。

（3）加待检血清及阳性血清对照、阴性血清对照　将待检血清用样品稀释液进行1∶50稀释，每孔加入100μl，每板同时设置两孔阳性血清对照、两孔阴性血清对照。当待检血清样品较多时，可根据试验进度，提前进行样品稀释，再一并加样，以确保所有待检样品的反应时间准确、一致。37℃作用1h，洗板同（1）。

（4）加酶标抗体　将兔抗猪酶标抗体用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度，每孔加入100μl，37℃作用1h，洗板同（1）。

（5）加底物显色液　每孔加入100μl底物显色液，37℃避光显色作用10min。

（6）加终止液　每孔加入100μl终止液终止反应，10min内测定OD450值。

（7）结果判定　在酶联免疫检测仪上读取OD450值，计算阳性血清对照OD450平均值ODP、阴性血清对照OD450平均值ODN。阳性血清对照OD450平均值ODP≥0.5，阴性血对照OD450平均值ODN≤0.2时，试验成立。待检血清样品的OD450≥0.2×ODP+0.8×ODN判为阳性，反之判为阴性。

4.注意事项

（1）相关试剂需在2～8℃保存，使用前平衡至室温。

（2）操作时，注意取样或稀释准确，并注意更换吸头。

（3）底物溶液避光保存，避免与氧化剂接触。

（4）终止液有腐蚀作用，使用时避免直接接触。

（5）废弃物处理参照中华人民共和国农业部〔2003〕第302号公告的规定进行。

附录A

（规范性附录）

猪细小病赛VP2蛋白的表达及纯化

A.1　材料和试剂

猪细小病毒NADL-2株；大肠杆菌DH5a和BL21（DE3）感受态细胞、pMD18-T克隆载体ET-32a表达载体、核酸提取试剂盒、质粒提取试剂盒、限制性内切酶、蛋白纯化试剂盒、培养基均为商品化试剂。

A.2　器材和设备

恒温培养箱、高速离心机、PCR扩增仪、核酸电泳仪和水平电泳槽、凝胶成像系统（或紫外透射仪）、恒温空气浴摇床、移液器（10μl、200μl、1000μl）、分光光度计等。

A.3　引物序列

VP2——P1：5’-AACAGGATCCCACAGTGACATTATG-3’

VP2——P2：5’-AGAAAGCTTATGCTTTGGAGCTCTTC-3’

A.4　猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因序列

本标准表达的猪细小病毒结构蛋白VP2抗原优势区基因序列如下：

CACAGTGACATTATGTTCTACACAATAGAAAATGCAGTACCAATTCATCTTCTA

AGAACAGGAGATGAATTCTCCACAGGAATATATCACTTTGACACAAAACCACTA

AAATTAACTCACTCATGGCAAACAAACAGATCTCTAGGACTGCCTCCAAAACTA

CTAACTGAACCTACCACAGAAGGAGACCAACACCCAGGAACACTACCAGCAGCT

AACACAAGAAAAGGTTATCACCAAACAATTAATAATAGCTACACAGAAGCAAC

AGCAATTAGGCCAGCTCAGGTAGGATATAATACACCATACATGAATTTTGAAT

ACTCCAATGGTGGACCATTTCTAACTCCTATAGTACCAACAGCAGACACACAAT

ATAATGATGATGAACCAAATGGTGCTATAAGATTTACAATGGATTACCAACAT

GGACACTTAACCACATCTTCACAAGAGCTAGAAAGATACACATTCAATCCACAAA

GTAAATGTGGAAGAGCTCCAAAGCAT

A.5　方法

A.5.1　VP2抗原优势区基因的表达质粒构建

将PPV接种PK15细胞，在5%CO2的条件下37℃培养24～36h，当70%的细胞出现细胞病变时，收集培养物，反复冻融3次。用核酸提取试剂盒提取病毒DNA，然后用VP2-P1和VP2-P2引物扩增VP2基因，琼脂糖凝胶电泳并纯化回收相应的扩增片段，片段大小为510bp。纯化产物连接pMD18-T克隆载体，转化DH5a感受态细胞，筛选获得的重组阳性质粒命名为pMD18-T-VP2。用BamHⅠ和HindⅢ双酶切pMD8-T-VP2和pET-32，将VP2基因片段连接到pET-32表达载体，转化DH5a感受态细胞，筛选获得的重组阳性质粒命名为pET-32a-VP2。

A.5.2　VP2抗原优势区基因的表达与纯化

将pET-32a-VP2转化BL21（DE3）感受态细胞，筛选获得含重组质粒的阳性菌株。取重组BL21（DE）菌种5μl，接种至5ml含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基（蛋白胨1%，氯化钠1%，酵母提取物0.5%）。37℃振摇培养至OD600值为0.4～0.6时，加入终浓度为1mmol/L的异丙基β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）进行诱导，继续37℃振摇培养4h。按照蛋白纯化试剂盒说明书纯化目的蛋白（即VP2重组蛋白），目的蛋白大小约39.1kDa。

A.5.3　重组蛋白的纯度及浓度测定

取5μl重组蛋白进行SDS-PAGE电泳，考马斯亮蓝染色，用蛋白密度扫描分析纯度，重组蛋白的纯度应≥95%；用紫外分光光度计测定重组蛋白在280nm和260nm波长的OD值，计算蛋白浓度，重组蛋白的浓度应≥1mg/ml。将检测合格的重组蛋白，分装后－20℃保存。

附录B

（资料性附录）

溶液的配制

B.1　包被液（碳酸盐级冲液，pH9.6）

NaHCO3（分析纯）　　　　2.98g

Na2CO3（分析纯）　　 　　1.5g

加双蒸水至1000ml，混匀。

B.2　洗涤液（磷酸盐缓冲液-吐温，PBST，pH7.4）

NaCl（分析纯）　　　　　　　　 　8.0g

KH2PO4（分析纯）　　　　　　　　0.2g

Na2HPO·12H2O（分析纯）　　 　 　2.9g

KCl（分析纯）　　　　　　　       　0.2g

硫柳汞（分析纯）　　　　         　　0.1g

吐温-20（分析纯）　　　　       　　0.5ml

加双蒸水至1000ml，调至pH7.4。

B.3　封闭液（10%小牛血清/PBST溶液，pH7.4）

吸取小牛血清（优级）10ml，加PBST至1000ml，混匀。

B.4　样品稀释液（磷酸盐缓冲液，pH7.4）

NaCl（分析纯）　　　　　　　　　　 　8.0g

KH2PO4（分析纯）　　　　　　　　　　0.2g

Na2HPO4·12H2O（分析纯）　　　　 　　2.9g

KCl（分析纯）　　　　　　　　　   　　0.2g

硫柳汞（分析纯）　　　　　　　　 　　0.1g

加双蒸水至1000ml，调至pH7.4。

B.5　酶标抗体稀释液

同B.3封闭液。

B.6　底物显色液（TMB-过氧化氢尿素溶液）

B.6.1　底物液A

TMB（分析纯）200mg，无水乙醇（或DMSO）100ml，加双蒸水至1000ml混匀。

B.6.2　底物缓冲液B

Na2HPO4（分析纯）　　　        　6g

柠檬酸（分析纯）　　　            　9.33g

0.75%过氧化氢尿素　　　     　　6.4ml

加双蒸水至1000ml，调至pH5.0～5.4。

B.6.3　将底物液A和底物缓冲液B按1∶1混合，即成底物显色液。

B.7　终止液

将22.2ml浓H2SO4（98%）缓慢滴加入150ml双蒸水中，边加边搅拌，加双蒸水至200ml。