八、猪伪狂犬病

猪伪狂犬病是由猪伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PrV）引起的猪的急性传染病。该病在猪呈暴发性流行，可引起妊娠母猪流产、死胎，公猪不育，新生仔猪大量死亡，育肥猪呼吸困难、生长停滞等，是危害全球养猪业的重大传染病之一。

（一）病毒特征

伪狂犬病毒属于疱疹病毒科（Herpesviridae）、猪疱疹病毒属，病毒粒子为圆形，直径150～180nm，核衣壳直径为105～110nm。病毒粒子的最外层是病毒囊膜，它是由宿主细胞衍生而来的脂质双层结构。囊膜表面有长约8～10nm呈放射状排列的纤突。

伪狂犬病毒是疱疹病毒科中抵抗力较强的一种。在37℃下的半衰期为7h，8℃可存活46d，而在25℃干草、树枝、食物上可存活10～30d，但短期保存病毒时，4℃较－15℃和－20℃冻结保存更好。病毒在pH4～9之间保持稳定。5%石炭酸经2min灭活，但0.5%石炭酸处理32d后仍具有感染性。0.5%～1%氢氧化钠迅速使其灭活。对乙醚、氯仿等脂溶剂以及福尔马林和紫外线照射敏感。

伪狂犬病毒只有一个血清型，但不同毒株在毒力和生物学特征等方面存在差异。伪狂犬病毒具有泛嗜性，能在多种组织培养细胞内增殖，其中以兔肾和猪肾细胞（包括原I代细胞和传代细胞系）最为敏感，并引起明显的细胞病变，细胞肿胀变圆，开始呈散在的灶状，随后逐渐扩展，直至全部细胞圆缩脱落，同时有大量多核巨细胞形成。细胞病变出现快，当病毒接种量大时，在18～24h后即能看到典型的细胞病变。

实验动物也可用于病毒的分离。兔、1日龄小鼠对伪狂犬病毒的敏感性无显著差异，但成年鼠与新生鼠相比有较强的抵抗力。虽然鸡胚对伪狂犬病毒不很敏感，但鸡胚绒毛尿囊膜接种是最早用于病毒增殖和传代的方法。

伪狂犬病毒基因组是线状双链DNA分子，大小约150kb，（G+C）平均含量高达74%，具有典型的疱疹病毒基因组结构特征，由独特长区段、独特短区段及位于US两侧的末端重复序列（TR）和内部重复序列（IR）组成。

（二）临床症状

伪狂犬病毒的临诊表现主要取决于感染病毒的毒力和感染量，以及感染猪的年龄。其中，感染猪的年龄是最主要的。与其他动物的疱疹病毒一样，幼龄猪感染伪狂犬病毒后病情最重。

新生仔猪感染伪狂犬病毒会引起大量死亡，临诊上新生仔猪第1天表现正常，从第2天开始发病，3～5d内是死亡高峰期，有的整窝死光。同时，发病仔猪表现出明显的神经症状、昏睡、鸣叫、呕吐、腹泻，一旦发病，1～2d内死亡。剖检主要是肾脏布满针尖样出血点，有时见到肺水肿，脑膜表面充血、出血。15日龄以内的仔猪感染本病者，病情极严重，发病死亡率可达100%。仔猪突然发病，体温上升达41℃以上，精神极度委顿，发抖，运动不协调，痉挛，呕吐，腹泻，极少康复。断奶仔猪感染伪狂犬病毒，发病率在20%～40%，死亡率在10%～20%，主要表现为神经症状、腹泻、呕吐等。成年猪一般为隐性感染，若有症状也很轻微，易于恢复，主要表现为发热、精神沉郁，有些病猪呕吐、咳嗽，一般于4～8d内完全恢复。怀孕母猪可发生流产、产木乃伊胎或死胎，其中以死胎为主。无论是头胎母猪还是经产母猪都发病，而且没有严格的季节性，但以寒冷季节即冬末春初多发。

20日龄以上的仔猪到断奶后小猪症状轻微，体温升高到41℃以上，呼吸短促，被毛凌乱，不食或食欲减少，耳尖发紫，发病率和死亡率都低于15日龄以内的仔猪。

4月龄左右的猪，发病后只有轻微症状，有数日的轻热、呼吸困难、流鼻涕、咳嗽、精神沉郁、食欲不振，有的呈“犬坐”姿势（图1-52），有时呕吐和腹泻。

母猪有时出现厌食、便秘、震颤、惊厥、视觉消失或结膜炎，有的分娩延迟或提前，有的产下死胎、木乃伊胎或流产，产下的仔猪初生体小、衰弱，弱胎2～3d后死亡，流产发生率约为50%。

诊断中应注意本病不易与猪瘟、蓝耳病、细小病毒病、乙脑等病区别，确诊必须进行实验室检验。

伪狂犬病的另一发病特点是表现为种猪不育。近几年发现有的猪场春季暴发伪狂犬病，出现死胎或断奶仔猪患伪狂犬病后，紧接着下半年母猪配不上种，返情率高达90%，有反复配种数次都配不上的。此外，公猪感染伪狂犬病毒后，表现出睾丸肿胀、萎缩，丧失种用能力。

（三）病理变化

狂犬病毒感染一般无特征性病变。眼观主要见肾脏有针尖状出血点，其他肉眼病变不明显。可见不同程度的卡他性胃炎和肠炎，中枢神经系统症状明显时，脑膜明显充血，脑脊髓液量过多（图1-53），肝、脾等实质脏器常可见灰白色坏死病灶，肺充血、水肿和有坏死点。子宫内感染后可发展为溶解坏死性胎盘炎。

组织学病变主要是中枢神经系统的弥散性非化脓性脑膜脑炎及神经节炎，有明显的血管套及弥散性局部胶质细胞坏死。在脑神经细胞内、鼻咽黏膜、脾及淋巴结的淋巴细胞内可见核内嗜酸性包涵体和出血性炎症。有时可见肝脏小叶周边出现凝固性坏死。肺泡隔核小叶质增宽，淋巴细胞、单核细胞浸润（图1-54）。

（四）流行病学特征

伪狂犬病毒在全世界广泛分布。伪狂犬病自然发生于猪、牛、绵羊、犬和猫，另外，多种野生动物、肉食动物也易感。水貂、雪貂因饲喂含伪狂犬病毒的猪下脚料也可引起伪狂犬病的暴发。实验动物中家兔最为敏感，小鼠、大鼠、豚鼠等也能感染。关于人感染伪狂犬病毒的报道很少，并且都不是以病毒分离为报道依据。如土耳其及我国台湾曾报道有血清学反应阳性者。欧洲也曾报告数例因皮肤伤口接触病料组织而感染，主要表现为局部有发痒，未曾报告有死亡病例。最新的报道见于1992年，在波兰因直接接触伪狂犬病毒而感染的工人，首先是手部先出现短暂的瘙痒，后扩展至背部和肩部。

猪是伪狂犬病毒的贮存宿主，病猪、带毒猪以及带毒鼠类为本病重要传染源。不少学者认为，其他动物感染本病与接触猪、鼠有关。

在猪场，伪狂犬病毒主要通过已感染猪排毒而传给健康猪，另外，被伪狂犬病毒污染的工作人员和器具在传播中起着重要的作用。而空气传播则是伪狂犬病毒扩散的最主要途径，但到底能传播多远还不清楚。人们还发现在邻近有伪狂犬病发生的猪场周围放牧的牛群也能发病，在这种情况下，空气传播是唯一可能的途径。在猪群中，病毒主要通过鼻分泌物传播，另外，通过乳汁和精液传播也是可能的传播方式。

除猪以外的其他动物感染伪狂犬病毒后，其结果都是死亡。猪发生伪狂犬病后，其临诊症状因日龄而异，成年猪一般呈隐性感染，怀孕母猪可导致流产、死胎、木乃伊胎和种猪不育等。15日龄以内的仔猪发病死亡率可达100%，断奶仔猪发病率可达40%，死亡率20%左右；对成年肥猪可引起生长停滞、增重缓慢等。

伪狂犬病的发生具有一定的季节性，多发生在寒冷的季节，但其他季节也有发生。

（五）预防及治疗

本病无特效治疗药物，对感染发病猪可注射猪伪狂犬病高免血清，它对断奶仔猪有明显效果，同时应用黄芪多糖中药制剂配合治疗。对未发病受威胁猪进行紧急免疫接种。本病主要以预防为主，对新引进的猪要进行严格的检疫，引进后要隔离观察、抽血检验，对检出阳性猪要注射疫苗，不可做种用。种猪要定期进行灭活苗免疫，育肥猪或断奶猪也应在2～4月龄时用活苗或灭活苗免疫，如果只免疫种猪，育肥猪感染病毒后可向外排毒，直接威胁种猪群。另外感染猪增重迟缓，饲料报酬降低，推迟出栏，间接损失也是巨大的。

猪场要进行定期严格的消毒，最好使用2%的氢氧化钠（烧碱）溶液或酚类消毒剂。

在猪场内要进行严格的灭鼠，消灭鼠类带毒传播疾病的危险。

猪伪狂犬病和猪细小病毒病、猪蓝耳病、猪乙型脑炎为导致猪繁殖障碍的四大疾病。

防疫措施有伪狂犬基因缺失苗滴鼻给出生小猪。

也可用基因缺失灭活苗进行注射，具体方法如下：后备种猪基础免疫后，于配种前一个月肌内注射1头份。

妊娠母猪——产前4周肌内注射1头份。

生产公猪——每6个月肌内注射1头份。

若采取全群“一刀切”的免疫方法，每年至少3～4次（每3～4个月1次）。妊娠母猪在产前4周加强免疫1次。

仔猪——5～6周龄时（此时母源抗体较低）肌内注射1头份（若1日龄滴鼻时剂量减半）。感染压力大的猪场应于11～12周龄加强免疫1次。

（六）实验室检测

猪伪狂犬病毒荧光PCR检测

依据标准：GB/T 35911—2018。

1.仪器设备

荧光PCR检测仪、高速台式离心机、组织研磨器或研钵、普通冰箱2～8℃、普通冰柜－20℃以下、超低温冰箱－70℃以下、微量移液器、高压灭菌器。

2.耗材

1.5ml离心管、0.2ml PCR薄壁管或八连管

3.试剂

（1）除非另有说明，在检测中使用的试剂均为分析纯。

（2）DNAzol，商品化DNA抽提试剂，于2～8℃保存。

（3）无水乙醇，－20℃预冷。

（4）75%乙醇，由无水乙醇和双蒸水配制，－20℃预冷。

（5）8mmol/L NaOH溶液，配制见附录A。

（6）PBS缓冲液，配制见附录A。

（7）Taq酶及10倍Taq酶反应缓冲液：Taq酶浓度为5U/μl，Taq酶反应缓冲液Mg+浓度为15mmol/L。

（8）dNTPs：含dATP、dGTP、dCTP、dTTP各10mmol/L，－20℃保存，避免反复冻融。

（9）引物和TaqMan探针，其序列见附录B。

（10）伪狂犬病毒阳性对照样品和阴性对照样品：阳性品对照使用灭活疫苗或组织培养灭活毒，阴性品对照采用健康猪的组织。

（11）内参照质粒：带有人β-株蛋白基因的质粒。

4.样品采集和处理

（1）采样工具

1）手术刀、剪刀、镊子，经160℃干热灭菌2h。

2）一次性无菌采样拭子。

3）组织研磨器或者研钵，经160℃干热灭菌2h。

4）真空采血管。

（2）样品采集

1）血液样品采集：用无菌注射器采集血液，注入含1/10 4% EDTA溶液的无菌容器中，充分混匀，编号备用。

2）精液样品采集：按照GB/T 25172的方法采集和保存精液。

3）鼻拭子采集：用棉拭子取受检动物鼻腔分泌物，置于2ml PBS缓冲液中备用。

4）组织样品采集：取大脑海马背侧皮层、中脑、脑桥、三叉神经节、扁桃体、肺脏、淋巴结等组织，置于无菌离心管内，编号备用。

5）细胞培养物：细胞培养物反复冻融3次，第3次解冻后，将细胞培养物置于1.5ml无DNA酶的灭菌离心管内，编号备用。

（3）样品保存和运输　上述采集的样品可立即用于检测。不能立即检测的样品，在2～8℃下保存应不超过24h，（－20±5）℃下应不超过3个月，－70℃以下可长期保存。样品运送采用低温保存进行运输，并在规定温度下的保存期内送达。

（4）样品处理

1）血液和精液样品无需进行前处理，直接用于核酸提取。

2）鼻拭子样品：充分涡旋振荡含有鼻拭子的管1～3min，弃去拭子后2000r/min离心5min，取上清后用于后续的核酸提取。

3）组织样品：取1g解冻的组织，剪碎，加入2ml PBS缓冲液进行研磨，制备组织匀浆，8000r/min离心5min，取上清用于后续的核酸提取。

4）细胞培养物：4000r/min、4℃离心10min，取上清用于后续的核酸提取。

5.荧光PCR操作程序

（1）DNA抽提

1）在核酸提取区操作，DNA抽提使用DNAzol手工提取，也可以使用等效的商品化试剂盒提取。

2）取n个灭菌的1.5ml离心管，其中n为待检样品数+阳性对照+阴性对照，对每个离心管进行编号。

3）每管先加入800μl DNAzol，再分别加入被检样品、阳性对照、阴性对照各200μl，颠倒10次混匀，4℃或室温10000r/min离心10min。

4）取900μl上清，置新的1.5ml灭菌离心管中，加入500μl无水乙醇，混匀，室温放置3min，4℃或室温10000r/min离心5min。

5）弃上清，沿管壁缓缓加入0.8～1ml 5%乙醇，颠倒3～6次混匀，4℃10000/min离心5min，反复洗涤次后，将离心管倒扣于吸水纸上自然晾干或用移液器移去残液。

6）用30μl 8mmol/L NaOH溶液溶解沉淀，DNA在2～8℃冰箱可保存2个月，－20℃冰柜可稳定保存两年。

（2）荧光PCR检测

1）反应体系的配制　在试剂配制区进行。设实时荧光PCR反应管数为n，n为待检样品数+阳性管数+阴性管数，每个反应的体系见附录C，为了避免移液器取样损失，建议按n+1个反应进行配制。配制反应液在冰盒中进行。

2）反应液的分装　将1）中配制的荧光PCR反应液充分混匀按每管39.8μl分装于0.2ml透明PCR管内，将PCR管置于96孔板上，按顺序加样并做好标识，转移至核酸提取区。

3）加样　在核酸提取区进行。在每个PCR反应管内加入0.2μl内参照质粒，并分别加入（1）中制备的10μl DNA溶液，盖上盖子、500～1000 r/min离心30s转移至检测区。

4）上机检测

① 荧光通道设置。将（2）、3）中离心后的PCR管放入PCR检测仪内，设置荧光探针：5’选择FAM、HEX和ROX三个荧光通道，3’均选择无（Nonc）荧光。

② 循环条件设置与检测

第一阶段，预变性50℃/2min；

第二阶段，预变性95℃/2min；

第三阶段，变性95℃/15s退火、延伸、荧光采集60℃/30s，40个循环；

第四阶段，冷却，25℃/10s。

检测结束后，保存结果，根据收集的荧光曲线和Ct值判定结果。

6.结果判定

（1）阈值设定　阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增的最高点为准。

（2）质量控制

1）PRV阴性对照：FAM通道无报告Ct值或无典型的S形扩增曲线，HEX通道无报告Ct值或无典型的S形扩增曲线，ROX通道Ct值≤36，且扩增曲线为典型的S形。

2）PRV阳性对照：FAM通道Ct值≤30，HEX通道Ct值≤30，ROX通道Ct值≤36，且3个通道的扩增曲线均为典型的S形。

3）以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。

（3）结果描述及判定

1）被检样本检测结果中FAM通道Ct值≤38、HEX通道Ct值≤38，且扩增曲线均为典型的S形曲线，报告为PRV核酸阳性；38<Ct值≤40，判定为可疑，可疑样品须重复检测。如重复后仍然38<Ct值≤40，且扩增曲线均为典型的S形曲线，报告为PRV核酸阳性。

2）被检样本检测结果中FAM通道Ct值≤40，且扩增曲线为典型的S形扩增曲线，HEX通道无Ct值或者无典型的S形扩增曲线，报告为PRVgE缺失株核酸阳性。

3）被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S形扩增曲线，同时ROX通道Ct值≤36且扩增曲线为典型的S形曲线，则该样本超过本方法检测灵敏度范围，报告为PRV核酸阴性。

4）被检样本检测结果中FAM通道和HEX通道均无Ct值或无典型的S形扩增曲线，同时ROX通道Ct值>36，则该样本的检测结果无效，应查找并排除原因，并对此样本进行重复实验。

附录A

（规范性附录）

溶液配制

A.1　8mmol/L NaOH溶液

称量0.32g NaOH，溶解到1000ml去离子水中，混匀、分装，常温保存。

A.2　磷酸盐缓冲液（0.01mol/L PBS，pH7.4）

用800ml蒸馏水溶解8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4。用HCl调节溶液的pH至7.4，加水至1L。分装后经121℃、15min高压灭菌后备用。

附录B

（规范性附录）

引物和探针

引物、探针的名称和序列见表1-14。

附录C

（规范性附录）

荧光PCR反应体系

荧光PCR反应体系见表1-15。