六、鸡传染性法氏囊病

鸡传染性法氏囊病（Infoecious bursal disease，IBD）又称甘布罗病，是由传染性法氏囊病毒引起的幼鸡一种急性、热性高度接触性传染病。主要症状为发病突然，传播迅速，发病率高，病程短，剧烈腹泻，极度虚弱。特征性的病变是法氏囊水肿、出血、肿大或明显萎缩，肾脏肿大并有尿酸盐沉积，腿肌、胸肌出血，腺胃和肌胃交界处条状出血。幼鸡感染后，可导致免疫抑制，并可诱发多种疫病或使多种疫苗免疫失败，是目前危害养鸡业的最严重的传染病之一，OIE将本病列为B类动物疫病，我国把其列为二类动物疫病。

本病最早于1957年发生于美国特拉华州的甘布罗（Gumboro），所以又称为甘布罗病（Gumboro disease），1962年 Cosgrove首次对该病进行了描述，目前在世界养鸡的国家和地区广泛流行。我国于1979年先后在北京、广州等地发现本病并分离到病毒，之后逐渐蔓延至全国各地，是近年来严重威胁我国养鸡业的重要传染病之一。

（一）病毒特征

传染性法氏囊病病毒（Infectious bursal disease virus，IBDV）又名传染性囊病病毒，属于双RNA病毒科（Birnaviridae）、禽双RNA病毒属（Avibirnavirus）。IBDV是禽双RNA病毒属的唯一成员。它的基因组由两个片段的双股RNA构成，故命名为双股双节RNA病毒。病毒是单层衣壳，无囊膜，病毒粒子呈球形，直径50～60nm，20面立体对称，基因组含A、B两个线状双股RNA分子。病毒无红细胞凝集特性。

IBDV由5种结构蛋白组成，分别为VP1、VP2、VP3、VP4、VP5。VP2能诱导产生具有保护性的中和抗体，VP2与VP3是IBDV的主要蛋白，可共同诱导具有中和病毒活性的抗体产生。抗VP2单克隆抗体可鉴别病毒的2个血清型，而抗VP3单克隆抗体能确定2个血清型共有的群特异性抗原。目前已知IBDV有2个血清型，即血清Ⅰ型（鸡源性毒株）和血清Ⅱ型（火鸡源性毒株）。二者有较低的交叉保护，仅Ⅰ型对鸡有致病性，火鸡和鸭为亚临诊感染。采取交叉中和试验，血清Ⅰ型毒株可分为6个亚型（包括变异株），这些亚型毒株在抗原性上存在明显的差别，用交叉中和试验测知亚型间的相关性为10%～70%，这种毒株之间抗原性差异可能是免疫失败的原因之一。Snyder等用单抗反应证明，IBDV Ⅰ型病毒在田间已发生一种主抗原漂移。毒株的毒力有变强的趋势，1990年初，在美、欧及东南亚从用经典疫苗株免疫的鸡群中分离到Ⅰ型的高毒力变异株，被称为超强毒株（Very virμlent strain），病死率超过50%。

本病毒能在鸡胚上生长繁殖，经尿囊腔接种所繁殖的病毒滴度比毛尿囊膜（CAM）接种低，而卵黄囊接种者介于二者之间。因此分离病毒的最佳接种途径是CAM。病毒经CAM接种后3～5d鸡胚死亡，胚胎全身水肿，头部和趾部充血和小点出血，肝有斑驳状坏死。由变异株引起的病变仅见肝坏死和脾肿大，不致死鸡胚。

在鸡胚中适应的IBDV毒株也能适应细胞培养，其中包括鸡胚成纤维细胞（CEF）、鸡胚肾细胞（CKC）、鸡淋巴细胞（LSCC-BK3）、鸭胚细胞、鸡胚法氏囊细胞（CEB）和一些禽源及哺乳动物源传代细胞系。病毒能适应鸡源细胞培养，经2～3代后，可产生细胞病变，并能形成蚀斑。初次分离的病毒不能适应鸡胚肾细胞培养，但在法氏囊细胞传4代后，可适应鸡胚肾细胞，连续传2代后，可产生细胞病变和形成蚀斑，有些毒株不易在CEF上生长。LSCC-BK3可用于有些毒株的初次分离，从而省去了对鸡胚的适应过程，简化了试验操作。

病毒在外界环境中极为稳定，在鸡舍内可存活4个月以上，在饲料中可存活7周左右。根据报道，病鸡舍将病鸡清除后54～122d，再放入易感鸡仍可感染发病。病毒特别耐热，56℃ 3h病毒效价不受影响，60℃ 90min病毒不被灭活。对乙醚、氯仿不敏感，耐酸不耐碱，对甲醛、过氧化氢、复合碘胺类消毒药敏感，70℃ 30min可灭活病毒。

（二）临床症状

本病潜伏期为2～3d。根据临诊表现可分为典型感染和非典型（或叫亚临床型）感染。

典型感染多见于新疫区和高度易感的鸡群，常呈急性暴发，有典型的临诊表现和固定的病程。最初常见个别鸡突然发病，1d左右波及全群。病鸡精神委顿、羽毛蓬松（图1-23）、

采食减少、畏寒，常扎堆在一起，随即出现腹泻，排出白色黏稠和水样稀便，泄殖腔周围的羽毛被粪便污染。严重者病鸡头垂地，闭眼呈昏睡状态，对外界刺激反应迟钝或消失。后期体温低于正常，严重脱水，极度虚弱，最后死亡，病程1～3d。整个鸡群的死亡高峰在发病后3～5d，以后2～3d逐渐平息，病死率一般在30%左右，严重者可达60%以上。部分病鸡的病程可拖延2～3周，但耐过鸡往往发育不良，消瘦，贫血，生长缓慢。

非典型感染主要见于老疫区或具有一定免疫力的鸡群，或是感染低毒力毒株的鸡群。表现感染率高、发病率低、症状不典型、法氏囊萎缩、病死率较低，但由于产生免疫抑制严重，危害性更大。

（三）病理变化

IBD的病死鸡表现脱水，胸部、腿部肌肉出血（图1-24）。法氏囊的病变具有特征性，可见法氏囊内黏液增多，法氏囊水肿和出血，体积增大，重量增加（图1-25），比正常值重2倍以上，有些呈胶冻样水肿，5d后法氏囊开始萎缩，切开后黏膜皱褶多混浊不清，黏膜表面有点状出血或弥漫出血，严重者法氏囊出血肿大呈紫葡萄状，内有干酪样渗出物。肾脏有不同程度的肿胀。腺胃和肌胃交界处见有条状出血点。泄殖腔内积有大量灰白色稀粪，内含石灰渣样物质。盲肠扁桃体出血、肿胀，有时可见肝、脾、肺等器官出血。

非典型感染的病例常见法氏囊萎缩，皱襞扁平，囊腔内有干酪样物质。组织学变化，可见法氏囊髓质区的淋巴细胞坏死和变性，使正常的滤泡结构发生改变。淋巴细胞被异染细胞、细胞残屑的团块和增生的网状内皮细胞所取代。滤泡的髓质区形成囊状空腔，出现异嗜细胞和浆细胞的坏死和吞噬现象。法氏囊上皮层增生，形成一种柱状上皮细胞组成的腺体状结构，在这些细胞内有黏蛋白小体。脾脏生发滤泡和小动脉周围的淋巴细胞鞘发生淋巴细胞性坏死。肾组织可见异染细胞浸润（图1-26）。肝血管周围可见到轻度的单核细胞浸润。

（四）流行病学特征

易感动物：自然感染仅发生于鸡，各品种的鸡都能感染，但土种散养鸡发生较少。主要发生于2～15周龄的鸡，3～6周龄的鸡最易感，且在同一鸡群中可反复发生。1～14日龄的鸡通常可得到母源抗体的保护，易感性较小。成年鸡因法氏囊已退化，一般呈隐性经过，但近年有138日龄的鸡也发生本病的报道。人工感染3～6周龄的火鸡仅表现亚临诊症状，法氏囊病变仅见有组织学变化。国内有鸭和鹌鹑等自然感染发病的报道，并有人从麻雀中分离到病毒。

传染源：病鸡和带毒鸡是主要传染源，其粪便中含有大量的病毒，它们可通过粪便持续排毒1～2周。病毒可持续存在于鸡舍中。

传播途径：感染途径包括消化道、呼吸道和眼结膜等，带毒鸡胚可垂直传播。本病可直接接触传播，也可经病毒污染的饲料、饮水、垫料、用具、空气、人员等间接传播。

流行形式及因素：本病往往突然发生，传播迅速，当鸡舍发现有被感染鸡时，在短时间内该鸡舍所有鸡都可被感染，通常在感染后第3天开始死亡，5～7d达到高峰，以后很快停息，表现为高峰死亡和迅速康复的曲线。病死率差异很大，有的仅为3%～5%，严重发病群病死率可达60%以上，一般为15%～20%。据不少国家报道，发现有IBD超强毒毒株存在，病死率可高达70%。由于本病易造成免疫抑制，使鸡群对大肠杆菌病、新城疫、鸡支原体病等易感性增加，常出现混合感染，导致病死率升高；饲养管理不当、卫生条件差、消毒不严格等因素的存在可加重本病的流行。

本病无明显的季节性和周期性，只要有易感鸡存在并暴露于污染的环境中，任何时候均可发生。

（五）实验室检测

参照标准：GB/T 19167—2003。

1.病毒的分离及其鉴定

（1）材料准备　灭菌组织研磨器、离心机、37℃温箱、孵化器、灭菌吸管、橡胶吸头、灭菌小瓶、灭菌6#针头、灭菌注射器、石蜡。

（2）病料的采集和处理　采集具有病变的新鲜法氏囊，用加有抗生素（3000IU/ml青霉素和3000μg/ml链霉素）的胰蛋白酶缓冲液或生理盐水制成20%的组织匀浆液，在37℃作用30～60min，1500r/min离心20min，收集上清液。经菌检培养为阴性后作为接种材料。

（3）鸡胚接种

1）接种　将收集的上清液以每只0.2ml的量经绒毛尿囊膜接种9～11日龄无传染性法氏囊病母源抗体鸡胚或SPF鸡胚（无特定病原体鸡胚），接种后用石蜡封住接种孔。37℃孵育，每天照蛋检查，弃去24h内死亡的鸡胚。

2）鸡胚剖检结果判定

① 标准IBDV分离物接种后判定：标准的IBDV分离物接种鸡胚后3～5d可致鸡胚死亡，死亡鸡胚充血，在羽毛囊、趾关节和大脑有血斑性出血。肝脏多可见坏死，也可见色淡似熟肉样。

② IBDV变异株分离物接种后判定：IBDV变异株经毛尿囊膜接种鸡胚，一般不致死鸡胚，接种后5～6d剖检，可见鸡胚大脑和腹部皮下水肿、发育迟缓、呈灰白色或奶油色，肝脏常有胆汁着色或坏死，脾脏通常肿大2～3倍，但颜色无明显变化。

（4）易感雏鸡接种试验

1）接种　取（2）述及的病料上清液0.5ml，经点眼、口服感染5只14～21日龄无IBDV母源抗体鸡或SPF鸡。同时设健康对照组。接种3d后将鸡剖杀，检查法氏囊及脾脏。

2）剖检接种结果

① 标准IBDV接种结果：接种后偶见鸡死亡，剖检可见接种鸡法氏囊水肿、色黄，有时可见出血；脾脏有时可见轻度肿大，表面有灰色点状病变。健康鸡则正常。

② IBDV变异株接种结果：接种后不出现死亡，3d后剖检可见法氏囊萎缩、质硬，脾脏可见肿大1～2倍。健康鸡则正常。

（5）IBD病毒的鉴定

1）琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验　准备已知的特异性鸡传染性法氏囊病标准阳性血清，用法氏囊匀浆制备待检抗原，同时制备正常的法氏囊匀浆作对照抗原，按AGID常规法滴加抗原和血清进行扩散，如在抗原孔和血清孔之间出现白色沉淀线者判分离物为阳性。

2）直接免荧光法

① 材料及方法

a.高免血清：采用CJ801株毒制备的高免血清，经AGID测定效价为1∶128以上，经中和试验测定在212（1∶2048）以上。

b.直接荧光抗体的制备：采用33%饱和硫酸铵盐析，沉淀免疫球蛋白，经透析并通过 SepHadex G50柱去铵离子，用紫外分光光度计测定球蛋白浓度在20～25mg/ml左右，以异硫氢酸荧光素（FITC）按1%量采用热标记方法标记，再经透析和 SepHadex G50柱层析，收集荧光抗体，保存于－20℃冰箱备用。

c.标本的制备及染色：取分离株法氏囊制成冰冻切片或用其组织制成压片。待自然干燥，以4℃保存的冷丙酮溶液固定10min，0.1mol/L pH7.2盐酸缓冲液冲洗两次，蒸馏水冲洗一次，风干后用（1∶8）～（1∶16）荧光稀释液为工作液，滴加在切片上置湿盒中，在37℃温箱中静置30min，再经磷酸盐缓冲液、蒸馏水冲洗，风干，滴加甘油缓冲液封固、镜检。

② 镜检及判定标准：用荧光显微镜检查。采用法氏囊冰冻切片为荧光诊断标本，法氏囊病毒侵害法氏囊后主要表现在淋巴小叶的质部。首先在淋巴滤泡胞浆中发出颗粒状黄绿色荧光，胞核位于中间为暗色不发光，感染初期常见到“光轮”样结构的淋巴滤泡，感染最严重时由于大量病毒在胞浆中复制发出强荧光的亮斑。皮质不发光。具有上述淋巴图像者称为特异性荧光，判为阳性。根据荧光强弱、荧光细胞的数量及荧光结构的清晰度可判为“++++、+++、++、+”。淋巴小叶结构完整而清晰，又不发荧光者判为阴性。

2.琼脂免疫扩散试验

（1）试剂　抗原与标准阳性血清。琼脂板制备方法见附录A。

被检血清样品：被检鸡血清样品应新鲜，分离后56℃灭活30min，采血后分离的血清可以当天使用，也可置－20℃保存备用。

（2）操作方法

1）打孔　反应孔按画好的七孔图案打孔，中心孔径3mm，外周孔径3mm，外周孔与中间孔间距3mm，打孔时切下的琼脂可以吸出也可以用针头挑出。打好后，在酒精灯上适当加热平皿底部，使琼脂与玻璃平皿贴紧，避免由于打孔时导致琼脂与平皿脱离。

2）加样

① 抗体的定性与定量测定：若是做定性试验，不需要稀释血清，只将血清样品直接加入琼脂板孔中；但若要定量测定血清沉淀抗体滴度，可以在24孔或96孔V形培养板上稀释血清，各孔预先加入50μl PBS，然后倍比稀释血清，最后更换吸头由高稀释度开始加样。

② 抗原及血清在孔内的添加：如图1-27所示，中央孔⑦加抗原，①、④孔加阳性血清，②、③、⑤、⑥孔加被检血清，各孔加到孔满为止。如果定量检测血清的沉淀抗体，采用中央孔⑦加抗原，周围①～⑥孔依次加入各不同稀释度的血清样品。在琼脂板上另打二孔，打法及间距同图1-27，分别加入阳性血清及抗原，设立阳性对照。加盖将平皿置于湿盒或容器中，在37℃条件下反应，逐日观察，72h终判。

（3）结果判定

1）定性检测　被检血清孔与抗原孔之间形成致密沉淀线者，或者阳性血清的沉淀线向毗邻的被检血清孔内侧弯者，此被检孔血清判为阳性。

如被检血清孔与抗原孔之间不形成沉淀线，此被检血清判为阴性。

2）定量检测　当标准阳性血清孔与抗原孔产生致密沉淀线后，被检血清能与抗原产生沉淀线的最高稀释度即为该被检血清的沉淀抗体效价。

3.酶联免疫吸附试验

（1）鸡传染性法氏囊病病毒抗原的检测

1）材料准备

① 被检样品：送检的病、死鸡法氏囊。

② 标准阴性样品：标准阴性样品为健康鸡法氏囊组织浸液。

③ MR5000海标仪。

2）操作环境　10～30℃

3）操作程序

① 被检样品的处理：将送检的病、死鸡法氏囊剪碎研磨，按1∶5量加自来水，制成组织浸液，静置5min，取上清液进行检测。

② 加样：用小塑料管吸取上述被检法氏囊的组织浸液，加1滴（50μl，下同）到聚苯乙烯酶标板的小孔内。每1个样品用1个孔，同时设1个孔作对照。用小塑料管吸取标准阴性样品，向对照孔内滴入1滴，静置2min。

③ 洗涤：再向加样的小孔内滴入洗液1滴后，接着用自来水滴满小孔，洗2次，每次均充分甩干。

④ 加酶结合物：向加样的小孔内滴入酶标记结合物1滴，静置2min。

⑤ 洗涤：同③的方法，用自来水洗5次。

⑥ 显色：向加样的小孔内滴入底物1滴，紧接着滴入显色液1滴，在5min内判定结果。

4）结果判定

① 观察颜色的判定：孔内的液体显蓝色者，判为阳性；孔内的液体显无色者，判为阴性。

② 酶标仪检测的判定

a.加终止液：加显色液后5min，用小塑料管吸取终止液，向加样的小孔内滴入1滴，用酶标仪测定OD450的数值。

b.判定：

OD450=0.105定为临界值

OD450>0.105判为阳性。

OD450<0.105判为阴性。

（2）鸡传染性法氏囊病抗体的检测

1）材料准备

① 被检样品：送检的鸡血清。

② 标准抗原：标准抗原为鸡传染性法氏囊病毒抗原。

2）操作环境　同（1）、2）。

3）操作程序

① 被检样品的处理：用吸管吸取被检血清0.1ml，置于小瓶内，再用1支吸管吸取标准抗原0.1ml，加入同一小瓶内，使二者充分混合，静置5min。

② 对照样品的处理：用吸管吸取生理盐水0.1ml，置于小瓶内，再用另1支吸管吸取标准抗原0.1ml，加入同一小瓶内，使二者充分混合，静置5min。

③ 加样：用小塑料管分别吸取上述处理好的被检样品和对照样品，分别滴入1滴到聚苯乙烯酶标板的小孔内，每个样品用1个孔，静置2min。

④ 洗涤，同（1）、3）、③。

⑤ 加结合物：同（1）、3）、④。

⑥ 洗涤同（1）、3）、③。

⑦ 显色同（1）、3）、⑥。

4）结果判定

① 观察颜色的判定

孔内的液体呈无色者，判为阳性。

孔内的液体呈蓝色者，判为阴性。

② 酶标仪检测的判定

a.加终止液：加显色液后5min，用小塑料管吸取终止液，向加样的小孔内滴入1滴，用酶标仪测定OD450的数值。

b.判定：

OD450<0.105 判为阳性。

0.105<OD450<0.4判为弱阳性。

OD450>0.4 判为阴性。

附录A

（规范性附录）

琼脂凝胶的制备

试验中琼脂凝胶的制备方法为琼脂糖1g，氯化钠8g，苯酚0.1ml，蒸馏水100ml。先将琼脂糖加到蒸馏水中，加热溶化后再加入氯化钠、苯酚，最后用5.6%碳酸氢钠调pH值为6.8～7.2，将溶化并混匀的琼脂缓慢倒入平放的洁净玻璃平皿中，平皿中琼脂厚度要求3mm，冷却凝固后备用。