五、鸡传染性喉气管炎

鸡传染性喉气管炎（Infectious laryngotracheitis，ILT）是由传染性喉气管炎病毒引起的一种急性接触性呼吸道传染病。其特征为呼吸困难，咳嗽（咳出含有血液的渗出物），喉部和气管黏膜肿胀，出血并形成糜烂。该病传播快，死亡率高，是目前严重威胁养鸡业的重要呼吸道传染病之一，OIE将本病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。

本病1925年首次报道于美国，1930年证实病原为病毒，1931年统一命名为传染性喉气管炎，现已广泛流行于世界许多养禽的国家和地区；我国于1986年发现了血清学阳性病例，1992年分离到病毒。

（一）病毒特征

鸡传染性喉气管炎病毒（Infectious laryngotracheitis virus，ILTV），属疱疹病毒科禽疱疹病毒1型（Callid herpesvirus1）。病毒粒子呈球形，无囊膜的核衣壳直径大小为80～100nm，有囊膜的核衣壳为20面体对称，上有162个中空的长壳粒，中心部分由双股DNA所组成。病毒大量存在于病鸡的气管组织及其渗出物中。肝、脾和血液中较少见。

病毒容易在鸡胚中繁殖，通过鸡胚绒毛尿囊膜接种，48h后会形成白色不透明的痘斑，这是最为特征的病灶，使鸡胚感染后2～12d死亡。病毒易在鸡胚细胞培养物上生长繁殖，最早（接种后4～6h）的细胞变化为核染色质变位和核仁变圆；随后细胞质融合，成为多核的巨细胞合胞体，并且早在接种后12h便能检出核内包涵体，随着培养时间的延长，多核细胞的细胞质出现大的空泡，并且由于细胞变性而变得更为嗜碱性。

ILTV的不同毒株在致病性和抗原性均有差异，但目前只有一个血清型。由于不同毒株对鸡的致病力差异很大，给本病的控制带来困难，毒力可用对鸡胚的毒力、基因组DNA的酶切分析和DNA杂交等试验区分。高毒株的病死率为50%～70%，而低毒株病死率只有20%。

本病毒的抵抗力很弱，55℃只能存活10～15min，37℃存活2～24h，13～23℃能存活10d。对乙醚、氯仿、热和一般消毒剂都敏感，如3%来苏尔或1%氢氧化钠溶液1min即可杀死，在38℃肉汤中48h失活，55～75℃生理盐水中很快被灭活，未经冷藏的鸡气管组织中的病毒于4h内死亡，绒毛尿囊膜中的病毒在25℃下几小时即可灭活。冻干或－60～－20℃低温可长期保存。

病毒在甘油盐水中保存良好，37℃可存活7～14d，22℃可存活14～21d，4℃可存活100～200d。

（二）临床症状

潜伏期自然感染的为6～12d，人工气管内接种的为2～4d。急性感染的特征症状是鼻孔有分泌物，呼吸时发出湿性音，继而咳嗽和喘气。严重病例，呈现明显的呼吸困难（图1-20），甩头，咳出血痰或带血的黏液，有时还能咳出干酪样的分泌物；检查口腔时，可见喉部黏膜上有淡黄色凝固物附着，不易擦去，多为窒息死亡。病鸡精神沉郁、流泪、羞明、眼睑部肿胀、食欲减退、迅速消瘦、鸡冠发紫，有时排绿色稀粪，衰竭死亡。产蛋率可下降10%～20%或更多。病程5～7d或更长。有的逐渐恢复成为带毒者。

温和型感染多表现为黏液性气管炎、窦炎、流泪、结膜炎，有些呈地方流行性，其症状为生长迟缓，产蛋减少，严重病例见眶下窦肿胀，发病率仅为2%～5%，病程长短不一，病鸡多死于窒息，呈间歇性发生死亡。

（三）病理变化

典型的病变为喉头、气管黏膜充血和出血、肿胀，并覆盖有黏液性分泌物（图1-21），有时这种渗出物呈干酪样假膜或呈条状黏液出血块，甚至会完全堵塞气管。炎症可扩散到支气管、肺和气囊或眶下窦。比较缓和的病例，仅见结膜和窦内上皮的水肿及充血。

组织学变化主要见于喉头和气管，可见黏膜下水肿，有细胞浸润。在病的早期可见核内包涵体。

（四）流行病学特征

（1）易感动物　在自然条件下，主要侵害鸡，不同年龄的鸡均易感，但以4～10月龄的成年鸡症状最具特征。野鸡、孔雀、幼火鸡也可感染，而其他禽类和实验室动物有抵抗力。

（2）传染源　病鸡和康复后的带毒鸡是主要传染源。病毒存在于喉头、气管和上呼吸道分泌液中，通过咳出血液和黏液而传播；约2%康复鸡可带毒，时间可长达2年。现在用分子生物学方法已经证实三叉神经节是ILTV潜伏感染的主要部位，受到应激的潜伏感染鸡，ILTV可以被激活、大量复制并排出。

（3）传播途径　ILTV的自然侵入门户是上呼吸道和眼结膜，经消化道途径也能感染但很少见。易感鸡与接种活苗的鸡长时间接触，也可感染本病，说明接种活苗的鸡可在较长时间内排毒。被病鸡分泌物和排泄物污染的空气、设备、工作人员衣物、饲料和饮水，可成为传播媒介。目前还没有垂直传播的证据。

（4）流行形式及因素　本病一年四季均可发生，但以冬、春季节多发。在易感鸡群内传播很快，感染率可达90%以上，病死率为5%～70%，一般平均在10%～20%，高产的成年鸡病死率较高。急性病鸡传播本病比临诊康复带毒鸡的接触性传播更为迅速。

（五）预防及治疗

（1）预防　坚持严格隔离、消毒等措施是防止本病流行的有效方法，封锁疫点，禁止可能污染的人员、饲料、设备和鸡只的流动是成功控制的关键。野毒感染和疫苗接种都可造成ILTV带毒鸡的潜伏感染，因此避免将康复鸡或接种疫苗的鸡与易感鸡混群饲养尤其重要。

目前有两种疫苗可用于免疫接种。一种是弱毒疫苗，经点眼、滴鼻免疫。但ILT弱毒疫苗一般毒力较强，免疫鸡可出现轻重不同的反应（精神萎靡、采食下降或不食、闭眼流泪、呼吸音，有的出现和自然发病相同的症状），甚至引起成批死亡，接种途径和接种量应严格按说明书进行。另一种是强毒疫苗，可涂擦于泄殖腔黏膜，4～5d后，黏膜出现水肿和出血性炎症，表示接种有效，但排毒的危险性很大，一般只用于发病鸡场。首次免疫时间一般在35～40日龄，二免时间在90～95日龄。接种后四五天即可产生免疫力，并可维持大约1年。鸡群存在有支原体感染时，禁止使用以上疫苗，否则会引起较严重的反应，非用不可时，在接种前后3d内应使用有效的抗生素治疗支原体。

正在研制中的基因工程疫苗可以克服常规疫苗引起潜伏感染的缺点，结合使用隔离封锁和卫生措施，可望在ILT的区域性消灭计划中发挥重要作用。目前，我国正在中试的基因工程疫苗有“鸡传染性喉气管炎和鸡痘基因工程活载体疫苗”，经大量试验，具有安全、无副反应、高效等优点。本疫苗系用表达鸡传染性喉气管炎病毒gB重组鸡痘病毒的鸡胚成纤维细胞培养物，经反复冻融后，加冻干保护剂冷冻干燥而成。

对暴发ILT的鸡场，所有未曾接种过疫苗的鸡只，均应进行疫苗的紧急接种。紧急接种应从离发病鸡群最远的健康鸡只开始，直至发病群。

（2）治疗　使用药物是对症疗法，仅可使呼吸困难的症状缓解。发生本病后，可用消毒剂每日进行消毒1～2次，以杀死环境中的病毒，同时用氯本尼考、泰乐菌素、庆大霉素等药物进行治疗，防止细菌继发感染。中药制剂在生产上应用有较好效果，可根据鸡群状况选用。

（六）实验室检测

依据标准：NY/T 556—2002。

1.病毒分离鉴定技术

（1）材料准备

1）病料的准备

① 活体采样：用灭菌棉拭子深入口咽或气管采集分泌物，放入含青霉素4000IU/ml、链霉素4000μg/ml的无菌生理盐水中。也可用棉拭子刮取眼分泌物，放入含青霉素4000IU/ml、链霉素4000μg/ml的无菌生理盐水中。

② 尸体采样：无菌采取病死鸡喉头和气管，放入无菌的平皿或烧杯中，密封。

2）样品的运送　采集的样品应立即放入4℃冰箱保存，24h内送到实验室；不能在24h内送到实验室时，应将所采样品冷冻保存和运输。

3）样品处理

① 收到棉拭子样品后，先经冻融2次，并充分振动、挤干棉拭子，将样品液经10000r/min离心10min，取上清液，加入青霉素4000IU/ml、链霉素4000μg/ml，于37℃作用30min，作为接种材料。

② 组织样品：无菌条件下将组织剪碎，按1∶4加入生理盐水后用研磨器磨制成20%的匀浆悬浮液，再经10000r/min离心10min，取上清液，加入青霉素4000IU/ml、链霉素4000μg/ml，于37℃作用30min，作为接种材料。

（2）操作方法

1）样品接种　取经过处理的样品，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜。每枚0.2ml，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d，弃去24h内死亡的鸡胚，24～120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。有痘斑者，取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨后，置－20℃冻存备用；无痘斑者，亦取出鸡胚绒毛尿囊膜和尿囊液，无菌研磨，反复冻融，离心后，接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜盲传。如此盲传3代以上，如仍无病变，则判为鸡传染性喉气管炎阴性。

2）病毒鉴定　病毒分离物的鉴定：用鸡传染性喉气管炎标准阳性血清（效价在1∶32以上）和标准阴性血清与分离物做鸡胚中和试验，固定血清。

血清处理：将传染性喉气管炎标准阳性血清和标准阴性血清56℃灭活处理30min。

病毒稀释：将病毒分离物用含青霉素1000IU/ml、链霉素1000μg/ml的灭菌生理盐水稀释，稀释方法见表1-5。

病毒-血清混合液：设两排试验管，每排4个管，第1排每管放0.6ml标准阳性血清，第2排每管放0.6ml阳性血清，然后向每排1～4号试验管内分别加入2×10－5～2×10－2稀释的病毒悬液各0.6ml，将病毒-血清悬液混合并置冰箱（4～8℃）4h。

鸡胚接种及结果判定：取经处理过的病毒-血清混合液，分别接种9～12日龄的鸡胚绒毛尿囊膜，0.2ml/枚，每管接种5枚，接种后的鸡胚在37℃孵育，每天观察鸡胚2次，连续观察7d，弃去24h内死亡的鸡胚；24～120h内死亡的鸡胚，放4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成；120h仍不死亡的鸡胚，亦取出，置4℃冷却后，观察鸡胚绒毛尿囊膜上有无痘斑形成。记录观察结果，按半数致死量（Reed-Muench）方法计算EID50，计算方法见附录A。

（3）结果判定　如分离物能引起鸡胚绒毛尿囊膜出现典型的痘斑，并且经鸡胚中和试验，其阴性血清组和阳性血清组的EID50的对数之差大于或等于2.5时，则判定分离物为鸡传染性喉气管炎病毒。

2.琼脂凝胶免疫扩散试验

（1）材料准备

1）琼脂扩散抗原与标准阳性血清

2）被检血清　无菌采血，分离血清，4℃或－20℃保存备用。

3）琼脂平板　配制方法见附录B。

（2）操作方法

1）琼脂板打孔　在琼脂糖平皿上，按坐标纸上画好的梅花形（见图1-22）打孔，孔径4mm，孔间距3mm。挑出孔内琼脂，在火焰上封底。

2）加样　用微量移液器加样，中央孔（⑦孔）加抗原，①、③、⑤孔加标准阳性血清，②、④、⑥孔加待检血清，每孔均以加满不溢出为度。

3）反应　加样完毕后，静置10min，放入37℃带盖的湿盒中反应，分别在12h、24h、36h观察并记录结果。

（3）结果判定

1）判定方法　将琼脂板置暗背景或强光照射下观察。标准阳性血清孔与抗原孔之间出现一条清晰的沉淀线，则试验成立；若无沉淀线或沉淀线不明显，则试验不成立，应重做。

2）判定标准

① 被检样品孔与中央孔之间形成清晰的沉淀线，并与标准阳性血清孔的沉淀线相融合者，为阳性。

② 被检血清孔与抗原之间不形成完整的沉淀线，但标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线末端向被检血清孔的内侧弯曲，判为弱阳性。

③ 被检血清孔与抗原之间无沉淀线，标准阳性血清孔与抗原孔之间的沉淀线直伸向被检血清孔的边沿无弯曲者，判为阴性。

④ 有的被检血清与抗原之间可能出现两条以上沉淀线，其中一条与标准阳性血清-抗原间沉淀线融合者判为阳性；均不融合者为阴性，此沉淀线为非特异性沉淀线。

附录A

（规范性附录）

鸡胚半数感染量（EID50）测定方法（Reed-Muench法）

A.1　定义

鸡胚半数感染量（EID50）是指能使50%鸡胚感染的病毒量，常用Reed- Muench法计算。

A.2　计算公式

按式（1-4）、式（1-5）计算：

lgEID50=高于50%死亡率的病毒稀释度的对数+距离比例值×稀释倍数的对数　　（1-4）

距离比例值=　　（1-5）

A.3　举例

病毒毒价测定（接种数量0.1ml/枚）见表1-6。

表1-6中第1列为接种的稀释度，第2列为死亡鸡胚数，第3列为活鸡胚数，后面的两列分别是第2列和第3列的累计数。

距离比值===0.84

lgEID50=－5+0.84×（－1）=－5.84

EID50=10－5.84/0.1ml

附录B

（规范性附录）

琼脂平板制备方法

用含8%氯化钠的蒸馏水加万分之一叠氮化钠配制成1%琼脂糖，103kPa高压蒸汽灭菌或水浴加热使琼脂充分溶化，放入直径为85mm的培养皿中，每皿16ml，平置，室温下凝固后，置4℃备用。