实验三　福林-酚试剂法测定蛋白质的浓度

一、实验目的

1.学习利用呈色反应原理测定蛋白质浓度。

2.掌握福林（Folin）-酚试剂法测定蛋白质浓度的基本原理和操作。

二、实验原理

蛋白质或多肽分子中有带酚基酪氨酸或带有苯环结构的色氨酸，在碱性条件下，可使酚试剂中的磷钼酸化合物还原成蓝色（生成钼蓝和钨蓝化合物）。在一定范围内，蓝色的深浅与蛋白质的含量成正比，可用比色法测定。

三、器材和试剂

1.器材

牛血清蛋白片，722型分光光度计，试管×10，移液管0.50mL×4、0.10mL×2、0.20mL×2、5.0mL×1。

2.试剂

（1）福林-酚试剂A　碱性铜溶液。

甲液：取Na₂CO₃ 2g溶于100mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液中。

乙液：取CuSO₄·5H₂O晶体0.5g，溶于1%酒石酸钾100mL中。

临用时按甲∶乙=50∶1混合使用。（一日内有效）

（2）福林-酚试剂B　将100g钨酸钠、25g钼酸钠、700mL蒸馏水、50mL 85%磷酸及100mL浓盐酸置于1500mL的磨口圆底烧瓶中，充分混匀后，接上磨口冷凝管，回流10h，再加入硫酸锂150g，蒸馏水50mL及液溴数滴，开口煮沸15min，在通风橱内驱除过量的溴。冷却，稀释至1000mL，过滤，滤液呈微绿色，储存于棕色瓶中。临用时，用1mol/L的氢氧化钠溶液滴定，用酚酞作指示剂，根据滴定结果，将试剂稀释至相当于1mol/L的酸。

（3）1mg/mL牛血清蛋白溶液　称取1g牛血清蛋白片溶于0.9%氯化钠溶液中，并稀释至1000mL。

（4）未知样品溶液。

四、实验内容

1.标准曲线测定

取8支干燥的试管，编号，按表2-1顺序加入试剂，混匀，室温放置10min，各管再加福林-酚试剂B 0.5mL，30min后比色（500nm），记录各管吸光度数据，每个样品读数3次并记录。

2.样品测定

取2支干燥试管，编号，按测标准曲线方法（表2-1），依次加入样品溶液0.5mL，福林-酚试剂A 4.0mL，混匀静置10min，再加入福林-酚试剂B 0.5mL，混匀，反应30min后，500nm波长下测吸光度并记录。

五、结果与分析

将所记录数据填在数据记录表中（表2-2）。

换算各标准曲线点含蛋白质质量，以蛋白质质量为横坐标（mg）、吸光度为纵坐标，绘制标准曲线，求得标准方程和R²。将样品蛋白质吸光度代入方程，计算样品蛋白质含量。

六、思考题

1.说明福林-酚试剂法的优缺点。

2.福林-酚试剂法较双缩脲法灵敏，为什么？

3.为什么加入福林-酚试剂B后要马上混匀？

七、注意事项

1.在实验时，不要将牛血清蛋白和样液加反。

2.福林-酚试剂B加入后，应立即混匀。

3.一定要注意实验的时间，因为溶液的吸光光度值是随着时间延长在不断增大的，如果时间超过了30min，则测得的吸光光度值就不准确。

4.在使用分光光度计时，拿比色皿时要拿它的毛面，不可以用手接触它的光滑面，防止自己手上的油污使测量值不准确。

5.在擦拭比色皿时，要顺着一个方向擦。

6.在比色皿中装入的液体量约为比色皿体积的2/3。