实验二　蛋白质浓度测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质含量的原理和操作技术。

2.学会使用凯氏定氮仪。

二、实验原理

生物材料的氨基酸含量测定在生物化学研究中具有一定的意义，凯氏定氮法是目前常用的蛋白质含量测定方法。该方法是利用蛋白质中含氮量约为16%，且相对恒定，测出含氮量，从而可推知蛋白质含量。实验分消化和测定两个部分。

消化是有机物（蛋白质）与浓硫酸共热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，往往在消化时添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。以甘氨酸为例，消化过程可表示如下：

CH₂NH₂COOH+3H₂SO₄ 2CO₂+3SO₂+4H₂O+NH₃

2NH₃+H₂SO₄ （NH₄）₂SO₄

浓碱可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借水蒸气将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后使溶液中的氢离子浓度降低，然后用标准无机酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止，最后根据所用标准酸的物质的量（相当于待测物中氨的物质的量）计算出待测物中的总氮量。

本法适用于0.2 ～ 2.0mg的氮量测定。

三、器材和试剂

1.器材

凯氏定氮烧瓶，凯氏定氮蒸馏装置，50mL容量瓶，3mL微量滴定管，分析天平，烘箱，电炉，100mL蒸馏烧瓶，小玻璃珠，坩埚钳，锥形瓶，铁架台等。

2.试剂

（1）浓硫酸　200mL。

（2）粉末硫酸钾-硫酸铜混合物　16g（K₂SO₄与CuSO₄·5H₂O以3∶1配比研磨混合）。

（3）30%氢氧化钠溶液　1000mL 。

（4）2%硼酸溶液　5000mL。

（5）标准盐酸溶液　约0.01mol/L。

（6）混合指示剂（田氏指示剂）　由50mL 0.1%美蓝乙醇溶液与200mL 0.1%甲基红乙醇溶液混合配成，储存于棕色瓶中备用。这种指示剂酸性时为紫红色，碱性时为绿色。变色范围窄且灵敏。

（7）市售标准面粉和富强粉　各2g。

四、实验内容

1.样品处理

固体样品测定时需烘干至恒重。在称量瓶中称一定量磨细的样品（如0.1g左右的干燥面粉），然后置于105℃的烘箱内干燥4h。用坩埚钳将称量瓶放入干燥器内，待降至室温后称重，按上述操作继续烘干样品。每干燥1h后，称重一次，直到两次称量数值不变，即达恒重。

液体样品（如血清等），可取一定体积样品直接消化测定。

2.消化

取4个100mL凯氏烧瓶，标号。各加1颗玻璃珠，在1号及2号瓶中各加样品0.1g，催化剂（K₂SO₄-CuSO₄·5H₂O）200mg，消化液（浓硫酸）5mL。在3号及4号瓶中各加0.1mL蒸馏水和与1号及2号瓶相同量的催化剂和浓硫酸，作为对照，用以测定试剂中可能含有的微量含氮物质。每个瓶口放一漏斗，在通风橱内的电炉上消化。注意加样品时应直接送入瓶底，而不要沾在瓶口和瓶颈上。当消化开始时应控制火力，不要使液体冲到瓶颈。待瓶内水汽蒸完，硫酸开始分解并放出SO₂白烟后，适当加强火力，继续消化，直至消化液呈透明淡绿色为止。

定容：冷却后，加蒸馏水约10mL（注意慢加，随加随摇），然后将瓶中溶液倾入50mL的容量瓶中，并以蒸馏水洗烧瓶数次，将洗液并入容量瓶，用水稀释到刻度，混匀备用。

3.连接和洗涤凯氏定氮仪

按照图2-3连接凯氏定氮仪，在P₁、P₃、P₄位置夹上自由夹后，将其固定在铁架台上，并调试好。

①接通冷凝水，先向蒸汽发生器中加入一定量的水（先关闭进水口，以排水口高度为宜），将蒸馏水由加样室加入反应室，用电磁炉将其加热烧开，让发生器中蒸汽通过气孔进入反应室。

②将电磁炉移开片刻，打开自由夹P₃，使冷水进入蒸汽发生器，此时由于蒸汽发生器产生负压，将反应室中蒸馏水吸出，待蒸汽发生器水位距离反应室孔约2cm左右，关闭自由夹P₃，之后打开蒸汽发生器放水阀P₁，使水位下降到排水口高度。再次将蒸馏水加入到反应室中，如此反复清洗3～5次。

③清洗后在冷凝管下端放一锥形瓶（盛有5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示剂的混合液）。如不变色则表明蒸馏装置内部已洗涤干净。

4.蒸馏

（1）准备工作　50mL锥形瓶数个，各加入5mL 2%硼酸溶液和1～2滴指示剂，溶液呈淡紫色，用表面皿覆盖备用。关闭冷凝水，打开自由夹P₄，使蒸汽发生器与大气相通。将一个盛有硼酸和指示剂溶液的锥形瓶放在冷凝器下，并使冷凝器下端浸没在液体内。

（2）加样　用移液管取5mL消化液，细心地通过加样室加入反应室中，随后加入30% NaOH溶液5mL，立即关闭自由夹P₄，在加样漏斗中加少量蒸馏水做水封。

（3）蒸馏

①打开冷凝水（注意不要过快过猛，以免水溢出）。

②打开电磁炉，蒸馏开始，当观察到锥形瓶中的溶液由紫变绿时（约2～3min），开始计时，蒸馏3min，移开锥形瓶，使冷凝器下端离开液面约1cm，同时用少量蒸馏水洗涤冷凝管口外侧，继续蒸馏1min，取下锥形瓶，用表面皿覆盖瓶口。

蒸馏完毕后，应立即清洗反应室，方法如前所述。如此3～5次。最后将自由夹P₁、P₃同时打开，将蒸汽发生器内的全部废水换掉，继续下一次蒸馏。

待样品和空白消化液均蒸馏完毕，同时进行滴定。

5.滴定

全部蒸馏完毕后，用标准盐酸溶液滴定各锥形瓶中收集的氨量，硼酸指示剂溶液由绿变淡紫色为滴定终点。记录滴定现象和数据。

五、结果与分析

样品总含氮量计算公式如下：

式中，c为标准盐酸溶液物质的量浓度，mol/L；V₁为滴定样品用去的盐酸溶液平均体积，mL；0.014为氮的毫摩尔质量，g/mmol；V₂为滴定空白消化液用去的盐酸溶液平均体积，mL； W为样品质量，g；5为测定时消耗的消化液体积，mL；100为换算为每100g样品中所含有的含氮量。

若测定的样品含氮部分只是蛋白质，则样品中蛋白质含量：

蛋白质含量（g/100g）=总氮量×6.25

六、思考题

1.何谓消化？如何判断消化终点？

2.在实验中加入粉末硫酸钾-硫酸铜混合物的作用是什么？

3.固体样品为什么要烘干？

4.蒸馏时冷凝管下端为什么要浸没在液体中？

5.如何证明蒸馏器洗涤干净了？本实验应如何避免误差？

七、注意事项

1.测定开始前，要确保凯氏定氮仪已经洗涤干净。

2.在反应室中加入NaOH前，将冷凝管口浸没在硼酸指示剂溶液内，以确保产生的NH₃被硼酸全部吸收。

3.从观察到硼酸指示剂溶液变绿色开始，继续吸收冷凝液3min，并用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口。