第一讲　组织固定

在组织病理学中，不管是组织切片乃至电镜还是大体标本的保存，都必须进行及时的、适当的和有效的固定。组织只有经过固定，才能完成随后的一系列的制作，直至切片的最后完成。每个病理技术人员要想很容易地就把组织固定得很好，说起来容易，做起来难。很多固定的细节确实不易掌握，要想充分掌握固定的技巧，就必须深入掌握固定的原理，才能在所有病理过程中立于不败之地，在日常的病理制片中，经常发生因固定不好而出现的各种问题，有很多人看轻固定的重要性，而致使制作失败，为使广大病理技术工作者，能更好地掌握组织固定的规律和技巧。

问题1　组织固定剂是怎样精准分类的？

组织固定剂可分为：

1.细胞固有物质固定剂

即细胞核、内质网、线粒体、高尔基器、溶酶体、过氧体，细胞骨架，组织液，抗原、糖原等。

2.细胞形态固定剂

使细胞不变形，保持原有形状及性质。

3.对某些具有传染性标本的固定剂

能防止疾病的扩散，如结核、肝炎、麻风、性病等。

问题2　组织固定剂怎样精准使用？

组织固定剂的使用是非常有讲究的，不能胡乱使用，要保持使用的精准性，下面就针对这一问题给大家予以解答。

问题3　怎样对细胞核做最好的保存？

Zenker's液是一种专门的细胞核固定剂。该液是细胞学及病理学常用的细胞核固定剂，对细胞核固定效果最好，最适合于造血和网状内皮组织的固定。但对于含血量较多的组织标本尽量不要选Zenker's液固定。

问题4　怎样对细胞器做最好的保存？

细胞器 （organelle）是散布在细胞质内具有一定特定结构功能的微结构或微器官，包括内质网、线粒体、染色体、高尔基体、溶酶体、过氧体等，锇酸是最好的细胞器固定剂，它十分昂贵，其溶液呈中性反应，是一种强烈的氧化剂，不能与乙醇、甲醛液混用，锇酸是目前组织制片中一种对细胞里细微构造能够良好保存的最理想固定剂，因此在线粒体及其他细胞器的研究中常常使用。经锇酸固定后，还可防止用乙醇脱水时所产生的沉淀作用。但此种固定剂渗透十分薄弱，同时不易固定均匀，往往外边过度固定，而里边尚未固定完全。所以用作固定的材料应该愈小愈好。特点：中性；渗透力极弱。是电镜固定常用的固定剂；也是唯一能固定脂类分子的最好的化学固定剂。

问题5　怎样对细胞内抗原做最好的保存？

不同种类、浓度的固定剂对不同抗原的固定效果不同，对抗原活性的影响也不同。我们常用的组织固定剂像醛类、醇类及丙酮类都不能很好的对所有抗原起到保存作用，抗原活性较低，像甲醛还会使抗原被封闭，在染色中还需抗原修复。目前较为理想的固定剂是Metchcarn（甲醇60ml+氯仿10ml+乙酸10m l）和FineFIX固定液，与前面的固定液相比，FineFIX固定剂是以醇溶结构为基础，经高分子物质将被固定塌陷的细胞膜支撑起来，这样就彻底纠正了醇类固定剂对组织的收缩作用，从而产生较好的固定效果，它与甲醛的交联固定有本质的区别，能够相对有效地保存组织抗原、维护良好的细胞核和胞质形态学结构，同时能保护细胞膜的完整性，免疫组化染色效果极佳。

问题6　怎样对组织内的酶类做最好的保存？

酶有几大特性，首先酶具有高效率的催化能力；其效率是一般无机催化剂的107～1013。二是酶具有专一性，即每一种酶只能催化一种或一类化学反应。三是酶在生物体内参与每一次反应后，它本身的性质和数量都不会发生改变 （与催化剂相似）。再有酶的作用条件较温和，即酶所催化的化学反应一般是在比较温和的条件下进行的；在最适宜的温度和pH条件下，酶的活性最高，温度和pH偏高或偏低，酶活性都会明显降低。另外过酸、过碱或温度过高，会使酶的空间结构遭到破坏，使酶永久失活。0℃左右时，酶的活性很低，但酶的空间结构稳定，在适宜的温度下酶的活性可以升高。根据酶的这些特性，我们便可知如果能在满足前面条件的情况下，有很好的固定剂，能将酶的活性保存固定下来，就可以大大强化酶的显出率，从而使酶的染色效果更佳，目前最具优势的是丙酮固定剂，特别是低温下的丙酮固定，更能很好的固定酶类，是酶的最好固定剂。

问题7　怎样对组织内的糖原做最好的保存？

糖原又名肝糖，它贮藏于肝细胞及肌细胞细胞质中，其形状为大小不等的颗粒，遇碘则变褐色，易溶于水，机体坏死后，糖原即受到破坏，因此须采取新鲜标本，并及时固定。糖原不等于糖类，只是糖类的一种。糖类从组织化学技术的角度分类与生物化学的分类并非一致。从组织化学的角度，糖类可略分为多糖、中性黏液物质和酸性黏液物质及黏蛋白和黏脂质。多糖主指糖原，是由许多葡萄糖分子以糖苷键组成的聚合体。当机体死亡，即很快分解为葡萄糖。糖原的固定要及时，而且标本要新鲜。糖原为水溶性，在非水溶性固定剂 （如纯乙醇）中保存较好，但用无水乙醇作糖原的固定剂，也有它的弊病，因无水乙醇渗透较慢，而且容易产生极化 （极化是糖原颗粒趋向于细胞的一端）。故用Gendre或Rossman固定液是保存固定糖原的好配方。一般固定不少于24小时。

Gendre固定液 （苦味酸95%乙醇饱和液85ml+40%甲醛10ml+冰醋酸5ml）

Rossman固定液 （无水乙醇苦味酸饱和溶液90m l+甲醛10m l）

问题8　怎样对组织细胞形态做最好的保存？

固定的目的是用人为的方法尽可能使组织细胞的形态结构和化学成分保持生活状态，防止组织细胞死后发生自溶和组织腐败，固定还能增加组织块硬度，使其更容易切片，使不同的结构更容易染色。我们常规的组织细胞固定都采用甲醛固定的方法，即10%中性甲醛液，目前它仍是组织细胞的最佳固定液，但它的缺点也是明显的，首先它具很高的毒性，对病理技术人员有很大的危害性，再者经甲醛固定的标本不能满足一些特殊染色的需要，对组织细胞中的很多成分保存不力，所以，这种普遍使用一种固定剂的方法并不被提倡，我们应根据不同的组织细胞选用不同的固定剂，才能达到最好的固定效果。

1.脂肪组织 （如含脂肪较多的淋巴组织、脂肪瘤、乳腺组织等）：

可采用Bouin、FineFIX、锇酸等固定剂。

2.淋巴结、胸腺、脾脏：

可采用B-5固定液。

3.肾脏：

可采用乙醇Bouin液固定；肾穿标本可采用PB-FA（甲醛10mL+纯乙醇70m l+浓度为0.05mol/L pH 7.2磷酸缓冲液20ml）固定液。

4.前列腺、睾丸：

可采用Hollande固定液 （它 “软化”组织可避免切片脆裂，苦味酸会溶解掉红细胞，对骨髓活检标本还可以起到脱钙作用）。

5.肾上腺胞质中嗜铬微粒：

可采用Bouin固定液 （这种固定液对证明嗜铬细胞瘤的诊断很重要，但它只限于一些特殊的组织，而不是一种好的多用途的固定剂）。

6.肝组织：

可采用4%多聚甲醛固定液 （时间以24小时效果最佳）。

7.脑组织：

可采用4%多聚甲醛固定液 （固定24小时以上）。

8.神经组织；肌肉组织：

可采用Zenker或Kolmer固定液。Kolmer固定液 （5%重铬酸钾40ml+10%甲醛40m l+冰醋酸10m l+酸氯乙酸10m l+10%乙酸钠10m l）

9.骨组织：

可采用Muller液固定剂或FineFIX固定剂 （骨髓可采用Zenker-甲醛固定液；胎儿指骨可采用Helly固定液）。

10.软组织、皮肤组织：

可采用FineFIX固定剂。

11.食管、胃、肠管、胆囊、脉管、输卵管、膀胱等：

可采用FineFIX固定剂 （这些标本应纵向剖开，以使固定剂较容易的渗透进组织，这些器官因结缔组织和及其富含的浆膜和肌膜，固定剂渗透入组织是非常缓慢的，所以，固定时间应长一些，大约24小时）。

12.喉组织：

可采用FineFIX固定剂。

13.心脏：

可采用Helly固定液 （对心肌闰盘有很好的固定作用）。

14.细胞特殊颗粒、胰岛、腺垂体：

可采用Helly固定液。

15.眼球：

可采用Kolmer或Verhoeff（甲醛水溶液10ml，95%乙醇48ml，蒸馏水36ml，苦味酸1g，固定48小时）固定液。

16.胰腺、卵巢、涎腺、甲状腺及甲状旁腺组织：

可采用Bouin或Zenker固定液。

17.肺组织：

可采用Bouin或FineFIX固定液。

18.子宫及胎盘组织：

可采用FineFIX固定液。

19.指甲、钙化组织：

可采用Tellyesniczky（70%乙醇200ml+甲醛50ml+醋酸铵30g）固定液。

20.烧伤皮肤：

可采用A.G.M （70%乙醇80ml+冰醋酸10ml+甲醇10ml）固定液，固定24～48小时。

问题9　怎样在组织细胞染色中正确使用固定剂？才能达到最好染色效果？

固定剂的使用有很多讲究，不同的染色方法所显示的组织或成分不同，采用的固定剂也有很大差别，有些染色方法，采用常规固定剂固定组织，效果不是很好，须采用特殊的固定方法，才能达到染色的最佳效果。

问题10　结缔组织染色怎样正确使用固定剂？

1.马松三色染色：

Zenker液是马松三色染色的组织最佳固定剂，在三色染色中还作为媒染剂使用，是三色染色的特殊固定剂，其他固定剂都无法使三色染色达到理想效果，此固定液固定时组织不可过大（长宽各为2cm、厚度不可超过2～4mm），组织于6～8小时内即可固定完成，浸于此固定液过久，组织会变脆，固定后多余的固定液必须利用自来水冲洗，冲洗的时间约需1.5小时以上，若冲洗不完全时，残留的固定液将会抑制或影响以后染色之效果，于固定及冲洗后可将组织保存于70%乙醇中。

2.脂肪组织 （苏丹Ⅲ、苏丹Ⅳ、油红O）法染色：

冰冻切片，以70%乙醇固定为好，如使用Fine-FIX固定液效果更佳。

3.网织纤维 （Foot法）染色：

采用Zenker液固定较佳。

4.网织纤维 （Lillie、Lillie-Fullmer法）染色：

应采用Orth固定液固定。

5.胶原纤维 （Petersen酸性茜兰法）染色：

Helly、Bouin、Zenker液固定12～24小时。

6.横纹肌 （磷钨酸-苏木素染色法PTAH）染色：

采用Zenker液固定较佳，如果是采用其他固定液处理的切片，在短时间内再用Zenker液固定或其他含铬溶液处理，其染色效果会得到改善。Retterer煌黑染色法，应采用升汞饱和固定液固定。Puchtler偶氮桃红-鞣酸法，需采用Carnoy液固定3～6小时。横纹肌组织块染色，可采用硝酸乙醇液 （无水乙醇80ml+蒸馏水16ml+浓硝酸4ml）固定。Selge-Niesen酸性复红缺血心肌染色法，要使用甲醛碳酸钙固定液固定3～6小时。

问题11　骨及软骨组织染色怎样正确使用固定剂？

1.弹性软骨 （碱性蓝B法、Verhoeff-VG法）染色：

标本应固定于Zenker液内，脱汞处理后逐级乙醇由高至低到70%乙醇内。

2.纤维软骨 （MCT法）染色：

标本以Zenker固定效果最好，如采用常规甲醛固定就必须再经二次固定，即在切片染色前可用重铬酸钾-乙酸液 （重铬酸钾2.5g、乙酸5ml、蒸馏水95m l）媒染60分钟，但Zenker固定的组织需用0.5%碘酒溶液脱汞5～10分钟，经水洗后用95%乙醇脱碘5分钟，水洗后0.5%硫代硫酸钠水溶液漂白。（Romeis亚甲蓝）染色，标本应固定于Helly液内8小时。

3.骨基质 （Schmorl硫紫-磷钨酸法、Schmorl苦味酸-硫紫法）染色：

标本固定于Müller液 （重铬酸钾2.5g+硫酸钠1g+蒸馏水100m l）6小时。Müller固定液是骨组织的特殊固定液，很少用在其他组织，特别是一些骨的精细制片，在此固定液中固定的时间越长效果越佳，长的可3个月，此液固定缓慢，但固定均匀，收缩少，固定过程中需时常更换新液，固定后流水冲洗。

4.骨髓 （Delafied苏木素法）染色：

固定剂以选用Susa液为佳，它对组织作用快，收缩小渗透力强，特别是对硬组织效果很好，它可以使颗粒聚集或凝结，所以特别适用于骨髓组织。

5.骨肿瘤断端骨髓 （Leishman法）染色：

标本固定于Zenker固定液中20～30分钟，如用Zenker-甲醛-盐固定液固定时不得超过30分钟，如时间过长可引起组织收缩，有损随后的染色，随后的流水冲洗十分重要，它可将重铬酸钾去除，以保证制片的顺利进行，一般不少于3小时。

问题12　神经组织染色怎样正确使用固定剂？

1.神经髓鞘 （Loyez、Page法）染色：

应采用20%甲醛或甲醛钙液固定，不少于72小时；Kultschi tsky染色法，组织固定于Flemming液 （1%铬酸水溶液15ml+2%四氧化锇4ml+冰醋酸1ml）中72小时。Page搔洛铬花青法或Swank-Daveport法，组织固定于10%甲醛生理盐水或甲醛钙液中。

2.神经胶质细胞 （Gajal法）染色：

可固定于溴甲醛液 （溴化铵2g+甲醛15ml+蒸馏水85ml）中固定，2～5天。（Grono法）染色，组织固定于 （尿素4g+碘化钾6g+甲醛20ml+蒸馏水80ml） 液中24～48小时。

3.神经轴突 （Davenport-Windle-Beech法）：

固定于下液 （氢氧化铵2ml+无水乙醇98ml）。

4.神经元细胞 （Cox）染色法：

需固定于 （5%升汞液20ml+5%重铬酸钾液20ml+5%铬酸钾液16ml+蒸馏水44ml）先将升汞液和重铬酸钾液混合，重铬酸钾液入蒸馏水稀释，再使两者混合，否则易产生沉淀，固定24小时后，换新液。

5.神经纤维Ramony-Cajal三法：

①Ramony-Cajal氨乙醇法：组织固定于氨乙醇液 （95%乙醇50ml+28%浓氨液4～10滴）。②Ramony-Cajal吡啶法：组织固定于吡啶水溶液 （吡啶25～30ml+蒸馏水25ml）18～24小时。③Ramony-Cajal水合氯醛法：组织固定于 （水合氯醛5.5g+无水乙醇25ml+蒸馏水75ml）液中24小时，固定后水洗一次。

问题13　组织细胞器染色怎样正确使用固定剂？

1.中心体 （Ehrlich-Biondi法）染色：

应固定于Susa或Carnoy液中。

2.高尔基体 （Cajal硝酸铀法）染色：

应入硝酸钠固定液 （硝酸钠1g+蒸馏水100ml）内固定8～12小时。

3.线粒体 （Alimann-Meves酸性品红法）染色：

应固定于Regaud液内4天。

问题14　组织细胞内化学成分染色怎样正确使用固定剂？

1.糖原染色：

固定糖原的固定剂可采用含高浓度苦味酸 （Bouin液）、乙醇 （无水乙醇）、甲醛溶液（甲醛100m l+自来水900ml+NaCl 9g，先将NaCl溶于水，再加入甲醛。这也是一种较为简单的固定液，但由于加入NaCl，它是一种重金属盐物质，加入了它可促进和改善染色，增加染色的强度）、Garnoy液（甲醇75ml+冰醋酸25ml），糖原的固定要及时，而且标本要新鲜。如用无水乙醇作糖原的固定剂，有它的弊病，因无水乙醇渗透较慢，而且容易产生极化 （极化是糖原颗粒趋向于细胞的一端）。故Gendre液（苦味酸95%乙醇饱和液85ml+40%甲醛10ml+冰醋酸5ml）固定液效果较佳、Rossman液 （苦味酸无水乙醇饱和液90m l+甲醛10ml）固定剂，这些固定剂都可以最好地保存糖原。由于糖原极易溶于水，所以，组织在固定前不可用水或生理盐水浸洗。

2.黏蛋白 （酚蓝法）染色：

标本应固定于Carnoy液内3小时。

3.钙盐 （茜素红S法）染色：

需采用中性缓冲甲醛固定液，不能使用酸性固定剂，容易溶解钙盐，也不能使用中性甲醛钙固定液。

4.碱性磷酸酶 （钙钴法）染色：

冰冻切片用10%甲醛钙液 （4℃）冰箱中固定12～18小时；石蜡切片用丙酮 （4℃）冰箱中固定12～18小时，染色前再用新鲜冷丙酮换两次液，每次30～60分钟。

5.酸性磷酸酶 （硝酸铅法）染色：

冰冻切片，冷丙酮固定10分钟。

6.黏液物质 （异染反应Hoter法）染色：

切片置于升汞饱和水溶液内固定0.5～1分钟，升汞固定液是蛋白质的良好固定剂，由于其对糖类及黏液物质无固定作用，亦无破坏作用，所以，对于染色剂与黏液物质的着色有很好的促进作用。最好标本在升汞溶液中固定 （不需加入氯化钠或乙酸），固定后不必水洗，亦不必用碘乙醇作后处理，可直接投入纯乙醇急速硬化。

问题15　组织细胞内病原性沉积物染色怎样正确使用固定剂？

1.纤维素 （马休黄-酸性品红-苯胺蓝法）染色：

应采用甲醛-氯化汞固定液 （重铬酸钾2.5g+氯化汞6g+蒸馏水100ml+40%甲醛液5ml）甲醛应在用前加入，因在加入甲醛24小时后即生成沉淀而失效。固定时间12～24小时，组织流水冲洗一夜，切片应做除汞处理。

2.尿素结晶 （Oestricher苏木素法）染色：

应采用黄醇-冰醋酸固定液 （黄醇6g+无水乙醇35ml+冰醋酸65m l）6小时，临用前配制，组织不宜过厚，因尿素结晶易溶于水，所以不能用含水的固定液。

3.痛风结晶 （Mallory显示尿酸盐结晶法）染色：

在痛风结节或痛风性关节炎滑液内的尿酸呈酸性尿酸钠结晶，它可以溶于水，而不溶于醇和醚，所以，95%乙醇和丙酮是最好的固定剂。尿酸结晶具有在强日光灯下还原硝酸银的能力，尿酸盐染色主要用于痛风结节的病变观察。含有尿酸盐的组织如用10%甲醛液固定，可见尿酸盐为无定形物团块；而用乙醇或醚类固定时，则可见尿酸盐结晶呈辐射形针状、束状排列。

问题16　内分泌细胞染色怎样正确使用固定剂？

1.胰岛细胞 （Mallory法）染色：

需采用Bouin液固定，流水冲洗一晚，再行制片染色。

2.肾上腺嗜铬细胞 （甲苯胺蓝法，Wiesel法）染色：

应采用Regaud液固定，2～3天，每天换新液一次，再用3%重铬酸钾水溶液固定一天。

3.类癌 （嗜银反应-Grimelius硝酸银法）染色：

应使用不含乙醇的固定液，因乙醇能溶解嗜银颗粒。

4.肥大细胞 （甲苯胺蓝、Halmi改良法）染色：

应采用10%甲醛生理盐水固定液，常规脱水包埋制片。

问题17　其他染色怎样正确使用固定剂？

1.核酸 （DNA、RNA）甲基绿-派若宁染色：

组织固定于Garnoy中 （4℃）3～6小时，固定时间不宜太长，超过一天，染色不理想。

2.抗酸杆菌 （Ziehl-Neelsen法）染色：

此法用Zenker固定效果较好，其他固定液染色效果不佳。

问题18　如何看待甲醛固定液？

甲醛不能沉淀白蛋白及核蛋白，但能与蛋白质化合。它是一种应用广泛，使用简单的固定液，具有穿透力强、固定均匀、组织收缩小、硬度适当，适用于一般器官组织的固定及保存。尤其对脂肪、神经组织固定效果较好。更适于病理组织的制片及大体积标本的保存，一般组织需固定24小时以上，甲醛是一种强还原剂，不能与铬酸、重铬酸钾、锇酸等氧化剂混合；甲醛由于长期贮存，特别是低温气候，容易产生多聚甲醛，即溶液中的白色沉淀，在高温下又成为甲醛。不纯的甲醛易产生甲酸，使溶液变为酸性，影响核的染色。所以在备用的甲醛溶液中加入小量的醋酸钙、碳酸镁或大理石作为中和剂。非缓冲液配制的甲醛溶液容易产酸，固定组织容易形成甲醛溶液色素，对组织形态观察不利。甲醛还会溶解糖类和尿酸盐结晶；缓冲液可以维持pH对组织容忍性，其穿透性也好，小组织10mm×10mm×3mm固定6～24小时。能较好的保存组织抗原性。短时间固定会引起少量抗原掩蔽。抗原修复可以帮助抗原暴露。多数资料表明，长时间固定会严重损害组织的抗原性。甲醛具有很大的毒性，是病理技师的天敌，甲醛已经被世界卫生组织确定为致癌和致畸形物质，是公认的变态反应原，也是潜在的强致突变物之一，研究表明：甲醛具有强烈的致癌和促癌作用。

问题19　甲醛对技师的身体危害很大，如何辨别是否甲醛中毒，甲醛中毒的症状是什么？如何防范？

甲醛重度中毒可昏迷、血压下降、休克甚至心搏骤停而危及生命。甲醛特点：挥发的时间长，甲醛释放周期长达3～15年。甲醛在一定的温度、湿度下才向室内空气中散发。尤其供暖期和初春季节，室内一般全都封闭，空气不流动，造成室内甲醛浓度越来越高。

一、刺激反应

表现为一过性的眼及上呼吸道刺激症状，肺部无阳性体征，胸部X射线检查无异常发现。

二、诊断及分级标准

1.甲醛轻度中毒症状：

①可有明显的眼及上呼吸道黏膜刺激症状，体征有眼结膜充血、水肿，两肺呼吸音粗糙，可有干、湿性啰音，胸部X射线检查有肺纹理增多、增粗。以上表现符合急性气管-支气管炎。②一至二度喉头水肿。

2.甲醛中度中毒症状：

①持续咳嗽、咳痰、胸闷、呼吸困难，两肺有干、湿性啰音，胸部X射线检查有散在的点状或小斑片状阴影，以上表现符合急性支气管肺炎；②三度喉头水肿；③血气分析是轻度至中度低氧血症。

3.甲醛重度中毒症状：

①肺水肿；②四度喉头水肿；③血气分析呈重度低氧血症。

三、甲醛中毒处理方法

1.甲醛轻度中毒应迅速脱离现场，静卧、保温、必要时吸氧。出现上呼吸道刺激反应者至少观察48小时，避免活动后加重病情。

2.对接触高浓度的甲醛者可给予0.1%淡氨水吸入；早期、足量、短程使用糖皮质激素，可以有效地防止喉头水肿、肺水肿。

3.保持呼吸道通畅：给予支气管解痉剂，去泡沫剂，必要时行气管切开术。

4.合理氧疗。对症处理，预防感染，防治并发症。

5.其他处理：轻度和中度中毒治疗后，经短期休息，一般可从事原作业；但对甲醛过敏者应调离原作业；重度中毒视疾病恢复情况，酌情安排不接触毒物工作。

问题20　既然甲醛毒性这么大，有什么方法可以替代吗？

众所周知，能够应用于组织固定，替代甲醛的试剂不是很多，原因很简单就是能够替代甲醛而起到很好组织固定作用的化学试剂很难寻找，所以甲醛作为组织的最理想固定剂的地位还很难撼动，但目前已经有了比较理想的替代产品出现，并且在国外已有大量的应用，这也是全球环保意识反映到病理专业的必然结果，当前在国内已有几种这样的试剂在市场上销售，其中有国外进口和国内研制的品种，我们经过精心挑选，并经过多年的实际使用，已基本掌握了这些试剂在病理组织制片当中的特点和一些规律，并做了一定的比较和评估。我们认为FineFIX是可以确定的目前最好的甲醛替代物。

问题21　何为绿色环保固定剂？

绿色环保固定剂是指完全没有毒性作用，并能起到出色的组织细胞固定、保存作用的化学试剂，并且最好能够做到食品级，这是比较理想的绿色环保固定剂。但目前唯一能最接近这一点的只有FineFIX固定剂。

问题22　FineFIX固定剂的优势在哪里？

经过多年对采用FineFIX固定的多种组织的病理制片程序与甲醛的固定进行对比，标本数在几万例，得出的结果证实，FineFIX固定剂不但完全可以替代甲醛，而且效果还优于甲醛。FineFIX是一种以醇溶结构为基础的，不含甲醛的水溶性浓缩液，它无色、无味、无毒，用乙醇稀释后的配方已获专利，在国外已被推广使用。对病理组织标本的固定稳定可靠，在制作普通HE切片、特殊染色切片、免疫组化切片、冰冻切片、细胞学涂片等都达到了很好的固定效果，与甲醛固定的组织没有任何区别。

FineFIX固定剂特点：

1.与传统的甲醛固定相比，FineFIX固定剂是以醇溶结构为基础固定组织，再经高分子物质将被固定塌陷的细胞膜支撑起来，这样就彻底纠正了醇类固定剂对组织的收缩作用，从而产生较好的固定效果，它与甲醛的交联固定有本质的区别。

2.能够相对有效地保存组织抗原、维护良好的细胞核和胞质形态学结构，同时能保护细胞膜的完整性，免疫组化染色效果极佳。

3.处理组织效果好，其在固定过程中能较早开始脱水，快速去除组织中较多的脂质，FineFIX处理后的组织，在形态学上可保证很高的质量，不会因切片质量而影响诊断。

4.克服了以往纯乙醇固定液或乙醇类固定液所存在的明显的组织收缩、细胞空泡以及核固缩等缺陷 （主要仰仗其高分子的支撑作用）。

5.FineFIX无毒性，其在空气中的弥散值远远大于甲醛，由于其在空气中的弥散率低，故更加突出了FineFIX在维护实验室人员身体健康的优越性。

6.FineFIX不需像甲醛，用中和剂进行废液处理，它回收容易，以醇成分为主的FineFIX，可依据乙醇废液处理程序处理废液。

7.FineFIX在贮存及运输中可在极度低温环境下贮存及装运 （在-50℃的极低温条件下仍然不会凝结）。

8.非常适合冰冻切片的固定 （效果极佳）。

9.制片质量：经FineFIX固定后的组织，其制片效果较佳，由于其对组织固定作用较甲醛更具优势，比如其固定属于沉淀模式，其醇溶结构使其渗透更快，对脂质溶解性更强，再加上高分子物质对组织收缩的修复作用等，所以，制作的病理切片质量更加完美，染色效果也更鲜艳。

10.在免疫组化中的应用效果很好。

11.特殊染色：可依据已有的资料进行而无需任何变化。

12.细胞涂片：非常适合细胞学的固定。

13.冰冻切片：对冰冻切片效果最佳，基本与石蜡切片近似。

14.在进行分子生物学研究方面具有优势 （依据资料）。

问题23　FineFIX固定剂与常规固定剂在使用中有何不同？

FineFIX固定剂在使用中，与常规固定剂没有太大不同，要想很好的掌握它的使用规律，可参考（表 23-1）：

问题24　冰冻切片用什么固定液效果最佳？

冰冻切片的固定很重要，因冰冻切片本身的制片效果比石蜡切片要逊色许多，如果固定再不好，那组织细胞的呈现就会很差，也就使医生很难作出正确的诊断，目前来讲，多年的经验告诉我们冰冻切片固定液 （97ml甲醇+3ml冰醋酸）效果良好，甲醇也是较好的冰冻切片固定液，但最为理想的还要数FineFIX固定剂，这是一种高科技的产物，值得推荐使用。

问题25　一些特殊组织的固定有什么需要注意的吗？

这个问题提得好，人体的一些特殊组织的固定确实需要特殊的方法，才能取得好的制片效果。

1.比如骨组织的固定就需要特殊的处理，我们知道骨组织在病理制片时，需要把骨中的钙质脱掉，这个步骤与固定有着密切的关系，骨组织的固定一般采用两种方法，即固定后脱钙或固定脱钙同时进行，尽量不采用先脱钙后固定的方法。这里特别要强调的是，不是特殊需要，切忌使用酸性固定剂，如乙酸、苦味酸、三氯乙酸等，这些固定剂会使骨组织加速膨胀，破坏骨组织结构，使制片难以进行。

2.再有固定对于制作脂肪组织切片至关重要。送检的脂肪组织标本，如若作HE染色则应立即投入到新鲜的FineFIX固定剂，此固定液显示组织柔韧性好，收缩小，固定均匀，且有强脱脂作用，而AF液中的高浓度乙醇在高温下会使组织表面蛋白质迅速凝固，组织收缩，阻止甲醛向深部渗透而致固定不均匀，笔者发现临床送检的新鲜脂肪组织如若不经固定，直接取材投入于脱水机中，将导致脱水和浸蜡不足，无法切片。如若需显示脂质而作特染时，需用加钙的固定液固定，且固定时间宜长，以2～5周为宜，以利脂质的保存。

3.对于淋巴结的固定，应遵守以下原则：新鲜的淋巴结样本应尽快进行取材和固定。对于厚度为0.3cm的淋巴结组织块，采用10%中性缓冲甲醛溶液固定的时间以12小时为佳；对于厚度为0.2cm的组织块经6小时固定也可获较满意的制片效果。

4.肌腱组织最好采用Bouin液12～24小时，流水冲洗20分钟，苦味酸 （picric acid）不会使组织硬化，有软化肌腱的作用，故是肌腱固定的良好固定剂。

5.烧伤皮肤的固定，选用A.G.M固定液，可使烧伤皮肤固定均匀，因有冰醋酸所以渗透力较强，不会引起二次收缩变形。

6.眼球的固定十分重要，需采用眼球特殊固定液固定，西京固定剂既可保持较快的穿透作用，又避免了组织的硬化和过度收缩，因此可保留视网膜结构的完整。

问题26　固定液使用时有哪些基本原则和注意事项？

固定液使用时应遵循的基本原则和注意事项是：

1.为使组织固定充分，应做到固定容器要合适、固定时间要充足，固定液量要足够。固定组织时，应选择合适的容器、一般容器的容积是组织的10～15倍以上。标本瓶应选择瓶口较大的为宜，这样便于固定后的标本经小口瓶硬塞进去，这样不仅不利于标本取出，还可能造成人为挤压组织而致形态变化，对大件的标本应按巨检常规切片后放于容器固定。组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，反之。一般4～12小时或更长。在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。

2.固定组织时，应该使用足量的固定液，多比少好，一般应为组织体积的5～10倍，最少也不应少于五倍。标本最好悬浮于固定液之中，漂浮于固定液之上或沉于固定用器之底部，都不利于固定液对标本的渗入。如标本块多时，固定时不应重叠。不要先将标本块放入容器后再注入固定液，以免标本贴附于器皿，形成固定不均匀之弊。新鲜标本应及时固定，否则或因组织陈旧，或因固定不当，而使组织原有结构消失而影响观察。

3.标本经固定后，应及时制作切片，如不能及时制片，而该固定液又不能作为保存液时，应改换适当的保存液。

4.在配制混合液时，应了解每种固定剂的理化性质，氧化剂不能与还原剂混合，以免引起化学反应，失去固定作用。

5.对于某些需要制作神经染色和酶反应等组织的固定，要求较一般严格，组织的大小，固定的时间，温度的适当都应慎重考虑，尤其是对于酶反应的固定液，一般都要置于冰箱，在低温的条件下进行固定。固定不好，是得不到满意的切片和合乎标准的反应效果的。

6.任何固定液对人体都有损害作用，因此固定液的容器必须密闭，以防挥发损伤器官和眼睛，忌用手与固定剂直接接触，以免损伤皮肤。

问题27　在免疫组化技术中固定液应如何选用？

免疫组化染色标本在取材后需立刻投于固定剂中，固定使组织和细胞的蛋白质凝固，终止内源性或外源性酶反应，防止组织自溶或异溶，以保持原有结构和形态；对免疫组化而言更有原位保存抗原的作用，避免抗原失活或弥散。

常用固定液：免疫组化固定剂品种很多，但大多属于醛类和醇类。其固定原理不同，各有优缺点。醛类 （常用甲醛、戊二醛和多聚甲醛）、醇类 （常用乙醇、FineFIX）、其他 （丙酮）。

1.醛类：

甲醛应用最广。①优点：形态结构保存好，且穿透性强，组织收缩少。②缺点：甲醛放置过久可氧化为甲酸，使溶液pH降低，影响染色：醛基与抗原蛋白的氨基交联形成羧甲基，使抗原决定簇的三维构象出现空间障碍；分子间交联形成的网格结构可能部分或完全掩盖某些抗原决定簇，使之不能充分暴露。可造成假阴性的染色结果。③注意事项：缩短固定时间，降低固定温度 （4℃），为此组织块不宜过厚。改用中性缓冲甲醛溶液，以pH 7.2～7.4浓度0.01mol/L的磷酸盐缓冲液配制成10%甲醛固定液，减少固定液pH的变化。固定后充分水洗以减少分子间交联。切片在作免疫组化染色前，先经预处理使抗原再现 （抗原修复）。

2.戊二醛：

①优点：穿透性强，微细结构保存好。②缺点：对抗原有一定影响，常与其他固定剂联合用作免疫电镜固定液。

3.多聚甲醛 （常用4%）：

①优点：可用于免疫电镜；也可用于免疫荧光染色。主要检测组织内一些性能较弱的抗原特别是细胞表面抗原，对组织穿透性好，组织收缩小，对大多数抗原物质保存较好，特别是对脂肪和各种酶的固定效果更好，适用于免疫组织化学染色。②缺点：固定的时间宽容度小，以24小时以内为宜。

4.醇类：

最常用的醇类固定剂是乙醇，其固定作用是使细胞内蛋白、糖类发生沉淀。①优点：穿透性强、抗原性保存好。②缺点：脱水性强，易引起组织收缩、变硬，影响切片质量，因而乙醇固定时间不宜过长 （2小时内）。乙醇使蛋白变性的作用轻，固定后可再溶解；染色过程中，温育时间长，抗原可流失而减弱反应强度。

5.FineFIX固定剂：

在免疫组化中的应用效果很好。目前，对经甲醛溶液固定、石蜡包埋的组织进行抗原修复的处理流程极不规范，其主要原因是：甲醛溶液交联反应持续存在，组织在固定液中停留时间较长，因此免疫组化标记的敏感性与染色强度参差不齐也就在所难免了。但经FineFIX进行的固定属于自然沉淀模式，组织抗原特性不受影响，避免了因固定剂交联作用而产生的抗原数量上的衰减，因此，在进行抗原修复时，不必采取有破坏性的修复方法，从而使抗原修复技术更为标准化，FineFIX这种无交联反应的优势，提高了抗原对抗体的敏感性，因此在许多情况下，这种节约抗体的作用尤为明显，可以稀释抗体而减少抗体的用量，这样，对使用多克隆抗体的用户，一定分量的试剂在原有基础上增加了检测的例数。经过多年使用，针对FineFIX固定剂，笔者认为石蜡包埋组织的抗原修复流程应采用如下规则：①抗原修复温度低，一般不超过85℃。②抗体稀释度高，一般在1∶200左右。③很多抗体可不做修复也能达到很好的效果 （做了部分实验）。④所使用的抗原修复液没有变化，采用您工作室现有的、经过实践证明合适的抗原修复液均可。⑤达到抗原修复温度后 （85℃），修复15分钟，时间的长短取决于抗原决定簇的类型。

6.丙酮：

①优点：对抗原性的保存好。②缺点：脱水性更强，较少用于组织标本，但细胞爬片常用丙酮固定。

问题28　低温情况下组织固定如何处理？

冬季，我国大部地区的气温偏低。对于组织固定而言所用的时间必须延长，而实际工作中往往是当天的组织需要当天取材、固定、脱水，这样必然影响组织的切片.染色和诊断质量，可以采取一些方法予以补救。

1.方法一：

在低气温条件下经AFF固定液固定 （不加热50分钟或加热80℃，5分钟）的组织经脱水、切片、染色效果不理想，不加热固定效果不好，加热，组织发脆，着色不均。

2.方法二：

经10%甲醛溶液液固定80℃，5分钟的组织常规切片、染色结果令人满意.但免疫组化结果受到影响。

3.方法三：

经饱和苦味酸甲醛液固定60℃，5分钟的组织常规切片、染色非常好，免疫组化结果不受影响。

4.方法四：

采用FineFIX固定液，固定2小时，FineFIX固定液有一特点，即低温下固定效果良好。

问题29　聚乙二醇可以作为组织标本固定剂使用吗？

聚乙二醇 （PEG）是一种水溶性高分子化合物，有一系列由低到中等分子量的产品，其分子式为HO （CH2CH2O）n H （n=4～450）。根据分子量的大小不同，PEG物理形态可以从无色透明黏稠液 （200～700）到白色蜡质半固体 （1000～2000）直至坚硬的蜡状固体 （3000～20 000）。它完全溶于水，并和很多物质相溶，有很好的稳定性和表面活性，低毒且无刺激性。

由于PEG良好的生物相容性、反应简单、价格低廉等优点，受到较多的重视。PEG对组织具有脱水和固定作用已经得到了证实。也有研究报道将PEG用于动、植物标本的制作和保存，并也称其为塑化标本。此方法为陈洪等创建，现将此法介绍给大家。

1.方法：

从分子量为400～700的PEG中选取1种，用蒸馏水配制成浓度为25%～40%不同梯度的PEG溶液。将标本依次浸没在不同梯度的PEG溶液中，在每个梯度溶液中浸泡的时间7天 （可视标本的大小而定）。也可以在各梯度溶液中加入0.5‰的非离子氟表面活性剂，以降低溶液的表面张力，提高渗透性，达到缩短浸泡时间的目的。上述过程完成后，PEG即能完全替换标本组织内的水分。

2.效果：

①玻片标本镜下所见，30%PEG（300）和25%PEG（400）溶液固定的组织与甲醛溶液固定对照组的相似，而且细胞胞质染色更红，组织和细胞结构更清楚，细胞边界更清晰。说明组织固定良好，并优于甲醛溶液固定对照组。低于上述浓度，溶液的固定效果稍差，而溶液浓度高于70%的，则造成组织块过硬，切片难度大。镜下观察组织表层染色过深，有一明显暗红色带，核皱缩；而深部则染色较浅，细胞有大小不一的空泡，内皮细胞不清。这说明浓度过高会使组织表层固定脱水过度和过快，影响渗透力，造成组织深部固定不足，出现自溶现象。②PEG属中性，且无毒、无味、无刺激，是经FDA批准的极少数能作为体内注射药用的合成聚合物之一；它们是化学惰性的，不溶解脂和糖原，可以保存脂肪；具有很强的化学稳定性，不挥发，不易散失；具有表面活性，可降低表面张力，渗透性很强；具有溶解性，液体PEG可以任何比例与水混溶，而固体PEG则只有有限的溶解度；具有吸湿性，低分子量的PEG有能从大气中吸收并保存水分的能力，具有增塑作用，但随分子量的增大而迅速下降，6000以上的PEG具有很低的吸湿性；固体PEG还具有成膜性。利用以上特性，用高、低两种不同分子量的PEG综合应用于各类标本的制作和保存，效果令人满意。有研究表明，把病理学样品浸在液体PEG中，然后，再浸渍在熔融的固体PEG中，拿出样品固化PEG，并去掉固体PEG后，样品可长期地保存。

问题30　如何解决婴儿脑组织总因固定不良，切片效果较差的问题？

婴幼儿脑组织由于含水量较高而十分脆嫩，经甲醛常规固定后仍然易于破碎，难以检验，采用如下方法可提高制片质量。

1.方法一：

①日常病检婴儿尸体常规剖取脑组织，置盛有固定液的容器中。将脑组织沿大脑纵裂切开，大脑左右半球分别放入自制固定液中，应避免直接用手拿取未固定的脑组织。②试剂配制：固定液：40%甲醛150m l，无水乙醇460m l，甘油150m l，蒸馏水250m l，混合均匀。常规甲醛固定液：40%甲醛120ml，蒸馏水加至1000ml。③方法：脑组织在固定液中固定3天后冠状切开，更换固定液后再固定4天后常规进行取材，按常规方法制作切片，HE染色。

2.方法二：

①固定液：FineFIX固定液。②方法：将盛有FineFIX固定液容器放入冰箱，将新鲜婴幼儿脑组织放入容器中，4℃下固定4～5天。

问题31　病理标本固定不良应如何补救？

在病理制片过程中，组织固定是关键的步骤，良好的固定才能保证制片的顺利进行，现在几乎病理科都常规应用了组织自动脱水机，但有时因停电或电脑程序出现异常，导致脱水机计时功能紊乱或出现故障、标本取材过大、固定液未及时更换等原因，以致组织的处理无法正常进行或标本染色发灰，直接影响病理诊断。对一些无法重新取才的标本，如何补救呢？针对这个问题，做个补救方法的介绍：

操作方法：

1.把已包埋的固定不良的组织重新放入石蜡中融蜡，使组织周围多余的蜡去除。

2.把已除去石蜡的组织放入二甲苯 （或环保脱蜡剂）Ⅰ中30分钟，二甲苯Ⅱ30分钟，以去除组织内含有的石蜡。

3.把经过两道二甲苯的组织重新逐级放入乙醇。

4.无水乙醇Ⅰ→无水乙醇Ⅱ→95%乙醇→80%乙醇中各20分钟，此过程应注意各级乙醇应是初次使用，而且不可重复使用，以免已脱蜡的组织又重新沾上乙醇中含有的蜡。

5.如为胃镜取的小标本，组织已干枯，应在以上程序后水化，应放1%～2%冰醋酸内使组织软化后重新水洗，水洗时间视标本大小确定。

6.把经过各级乙醇浸泡的组织重新放入70%甲醛乙醇溶液中固定。

7.把经过二次处理的组织和下一批标本一起放入脱水机内常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片。

问题32　尸检组织应如何固定？

要制作出高质量尸检组织切片，组织标本固定不能忽略。高质量的组织切片基础是固定及时，如果固定不好，在以后的任何阶段都较难补救，选用了乙醇、甲醛溶液混合液固定，组织先固定10小时后，使固定液很快渗透到组织里，加快了固定速度，有效地防止了腐败，而且固定均匀，为再取材赢得了时间，同时也提高制片速度。

1.标本固定液：

尸检组织标本固定液一般浓度为10%中性甲醛溶液，而采用70%乙醇90ml、甲醛溶液10m l混合液固定效果更佳，尸检后的各脏器体积比较大，如固定不及时，易发生腐败、自溶，如心、肝、脾、肾、肺、脑较大组织的固定。

操作方法：应先用自制的混合液固定10小时左右，对组织渗透较快，尤其夏天温度较高时可有效地防止组织腐败，保持标本原型和结构，且具有硬化组织作用，便于取材。

此混合液不能用于长期固定大标本，应用浓度为8%甲醛溶液做长期固定。

2.取材与再固定：

根据需要对各器官进行再取材，切取0.3cm左右厚的组织块，用自制的混合液进行二次固定，半小时左右。

问题33　固定时间与标本体积之间是什么关系？

研究发现，影响固定剂组织弥散的因素是固定的深度与固定时间的平方根直接成比例，它在每种固定剂中大小不同。10%的甲醛溶液的弥散系数是0.79；100%的乙醇的弥散系数是1.0；3%的重铬酸钾的弥散系数是1.33，因此大多数固定剂的固定时间大约等于固定剂渗透组织的距离的平方。大多数固定剂，如NBF，大约1小时渗透1mm，对于一个10mm的球体，固定剂只有在52（即25）小时后才能渗透球体的中心。重要的是要注意，复合固定剂的不同成分有不同的渗透率，固定剂这些方面的特性在薄的组织内有最好的表现。

注意事项：①不要将大体标本置于固定容器的底部：应使用浸有固定剂的软纸或布将其与桶底分开，使固定液或处理液可以从各个方向浸入组织。②在处理前进行切片并储存在固定液中的没有固定的大体标本其厚度不应大于0.5cm。当打算将外科标本处理后放在包埋盒时，固定剂的渗透时间更关键。③固定过程缓慢，从形成反应性羟甲基到形成大量交联的时间尚不清楚。90%的反应基在冲洗4周后可被去除，说明交联形成不是一个快速的过程，可能需要数周才能完成。④蛋白质可使固定剂失活，特别是在血液中或血性液体中的固定剂。因此血性大体标本在放入固定液前应先用盐水冲洗。要获得理想的快速固定效果，固定液的体积至少应是标本体积的10倍。⑤现在薄的标本可在NBF中5～6小时来固定，其中包括在组织处理机内的短期固定。在如此快速的NBF“固定”中交联形成的量是不确定的，所以甲醛固定的机制大部分是由于形成羟甲基。⑥只要组织化学染色充分，快速固定或许是可以的；事实上，使用乙醛为基础的较短时间的固定可能可以提高免疫组化染色和其他分子学技术。

问题34　各种组织固定剂对比，各有什么优缺点？

各种固定剂都有各自的优势和缺陷，在使用时要仔细甄别，让组织都能得到最佳的固定效果，表34-1是各种固定剂的优劣对比，能使使用者对各种固定剂，有更为深刻的了解。