第三节　放射损伤响应的生物标志物

由于响应标志物与正常组织发生放射性损伤的发病机制密切相关，一方面可以作为在体的生物剂量计，同时又可以给放疗科临床医师开展生物适应性放疗提供依据，因而越来越多的基础以及临床研究正在探索适合作为正常组织发生放射性损伤响应标志物类的生物标志物。

口腔黏膜炎是头颈部肿瘤患者接受放疗后最为常见的正常组织急性放射性损伤，虽然确切的发病机制目前尚不明确，但普遍认为这是一种由放疗引起的口腔黏膜的急性炎症过程，以黏膜上皮萎缩、血管损伤以及炎性细胞浸润为特征。而C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）以及红细胞沉降率（erythrocyte sedimentation rate，ESR）是临床上应用广泛的急性期炎症标志物，早在二十世纪九十年代，就有学者报道接受术后辅助性放疗的子宫内膜癌患者以及子宫颈癌患者其血浆中CRP表达水平以及ESR均会显著提高。而目前，有三项临床试验探讨了接受同步放化疗的头颈部肿瘤患者在治疗开始后血浆中CRP表达水平以及ESR的变化，其中，三项研究结果均表明治疗开始后患者血浆中CRP的表达水平显著增加，并与患者发生的急性放射性黏膜炎的严重程度显著相关，而其中的两项试验表明治疗开始后患者的ESR显著增加，并与急性黏膜炎的严重程度同样相关。这些数据提示CRP、ESR等急性期炎症标志物可能可以作为预测放射性黏膜炎发生风险的潜在敏感生物标志物。

一些临床试验也已经探讨了白细胞介素等细胞因子对放疗致口腔黏膜炎症的预测作用。一项临床试验入组了11例接受根治剂量放疗以及同步化疗的头颈部上皮肿瘤患者，研究者分别在放疗前后不同时间点搜集了患者口腔中高剂量区域以及低剂量区域的唾液，而检测发现随着放疗剂量的增加，患者唾液中IL-6、IL-8等细胞因子的表达水平显著增加，且高剂量区域的表达水平要明显高于低剂量区域。而在另一项初步研究中，研究者同样入组了15例接受同步放化疗的头颈部上皮肿瘤患者，但与上述研究所不同的是，该项目的研究者选择分别在放疗前后不同时间点抽取患者外周血样本，而统计学结果同样发现放疗后血浆白细胞介素6的表达水平与患者发生较严重的放射性口腔黏膜炎及吞咽困难呈显著正相关，特别地是，放疗开始后两周血浆中IL-6的高表达还预示着患者需要接受经皮内视镜胃造口术管。在一项Ⅱ期随机对照临床试验中，研究者入组了58例接受同步放化疗的Ⅲ、Ⅳ期头颈部鳞癌患者，入组患者在接受同步放化疗的同时，还被随机分为接受放射防护剂阿米福汀（amifostine）治疗或安慰剂治疗，虽然设计该项研究的主要目的在于验证阿米福汀这一放射防护药物的有效性与安全性，但该研究同样发现患者放疗后发生放射性口腔黏膜炎时其血浆中白细胞介素6的表达水平要显著高于未发生口腔黏膜炎时，进一步证实了血浆中细胞因子白细胞介素6具有预测放射性口腔黏膜炎发生风险的潜能。

在一项入组了接受根治性同步放化疗的鼻咽癌患者的临床试验中，研究者通过酶联免疫吸附测定治疗前后这些患者血浆中TGF-β1的表达水平，并通过美国放射肿瘤学协作组（radiation treatment oncology group，RTOG）标准评估患者的放射性毒性反应，统计学结果证实治疗后患者血浆中TGF-β1的表达水平与放射性黏膜炎等毒性反应的严重程度显著正相关，而在后续开展的另一项入组接受同步放化疗的头颈部肿瘤患者的临床试验中，他们也得出了相类似的结论。在一项入组了13例头颈部肿瘤患者与18例对照组患者的临床试验中，研究者发现放疗会引起患者唾液中另一种生长因子——表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）表达水平的下降，而统计还发现EGF表达水平的降低与患者放射性黏膜炎的严重程度成正比。另一项类似的临床试验也提示：患者唾液中EGF的表达水平是头颈部肿瘤患者在接受放疗后发生放射性黏膜炎的潜在预测生物标志物。

在35例接受放疗的头颈部肿瘤患者，并在放疗前及放疗中分别获取每位患者的口腔黏膜上皮细胞涂片。结果表明对于那些放疗开始后未发生口腔黏膜炎的患者，其放疗前细胞涂片中促凋亡蛋白p53的阳性率仅有6.5%，而发生严重口腔黏膜炎（Ⅲ度）患者放疗前细胞涂片中p53的阳性率达到了43%。相反，未发生口腔黏膜炎的患者，其放疗前细胞涂片中凋亡抑制蛋白Bcl-2的阳性率高达100%，而发生严重口腔黏膜炎（Ⅲ度）患者放疗前细胞涂片中Bcl-2的阳性率仅有43%。此外，对于那些口腔黏膜炎严重程度逐步加重的患者，其前后两次细胞涂片中p53的阳性率也逐步增加，而Bcl-2的阳性率则逐步降低。相反，口腔黏膜炎严重程度逐步减弱的患者，其前后两次细胞涂片中p53的阳性率也逐步降低，而Bcl-2的阳性率则逐步增加。

对于腮腺、颌下腺等唾液腺的损伤以及功能下降，已有学者发现外照射放疗仅仅几小时后头颈部肿瘤患者血浆中唾液淀粉酶的表达水平便会显著增高，且其增加幅度与腮腺等唾液腺的受照体积与剂量成正比。与之相似，随后开展的一项临床试验同样发现接受碘131核素治疗的甲状腺癌患者，其血清中唾液淀粉酶的表达水平同样在治疗开始后显著增加，并且增加幅度与腮腺等唾液腺的受照射剂量成正比。这些临床研究数据提示外周血中唾液淀粉酶可以作为放射性唾液腺损伤的响应指标。而在最近开展的一项临床试验中，研究者入组了10例经过病理学确诊的口腔癌患者，随后在放疗开始前以及放疗后3周以及6周分别获取患者的口腔唾液，并检测这些唾液样本中淀粉酶的表达水平，结果显示与正常患者相比，这些口腔肿瘤患者放疗后唾液中淀粉酶的表达水平显著增加，同样提示唾液中淀粉酶的表达水平可以作为预测放射性唾液腺损伤的敏感生物标志物。

虽然目前对放射性肺炎的确切发病机制还不了解，但有学者认为放射性肺炎是机体对放疗的炎症性反应。全血白细胞计数（systemic white blood cell，WBC）是炎症反应的指标之一，因而美国MD Anderson肿瘤中心开展的一项回顾性临床试验入组了366例接受根治性放疗的非小细胞肺癌患者，他们发现发生严重放射性肺炎（≥3级）患者其放疗后全血白细胞计数要显著增加，而单因素、多因素分析则进一步证实放疗后全血白细胞计数是患者发生放射性肺炎的独立危险因素之一，提示全血白细胞计数结合物理剂量学参数可能可以用于预测胸部肿瘤患者放疗后发生放射性肺炎的风险。然而目前该预测方法的准确性还需要更大样本量的临床试验得以证实，同时还需进一步探究全血白细胞计数的合理数值。

在白（淋巴）细胞中，辅助性T细胞17（T helper cells 17，Th 17）以及调节性T细胞（T regulatory cells，Tregs）均在炎症性疾病过程中扮演了十分重要的角色，因而有临床研究探讨了患者外周血中辅助性T细胞17与调节性T细胞数量变化与放射性肺炎之间是否相关。研究者入组了147例接受根治性或姑息性放疗的局部晚期食管癌患者，并通过流式细胞术检测患者放疗前后不同时间点外周血中辅助性T细胞17与调节性T细胞的数量，其研究结果发现与未发生放射性肺炎患者相比，发生放射性肺炎患者在放疗后外周血中辅助性T细胞17数量显著增加，同时调节性T细胞数量显著减少，而辅助性T细胞17/调节性T细胞比例显著增高，提示外周血辅助性T细胞17/调节性T细胞比例可能是另一种能有效预测放射性肺炎发生风险的急性期炎症反应标志物。

中性粒细胞-淋巴细胞比例（neutrophil-lymphocyte ratio，NLR）已被证实是十分重要的炎症指标，能准确反应炎症状态的严重程度。在一项回顾性临床试验中，研究者入组了83例接受根治性同步放化疗的Ⅲ期NSCLC患者，经过中位时间为11.6个月的随访，研究者发现放疗开始后39%的患者发生了Ⅰ度放射性肺炎（仅影像学改变），18%的患者发生了有症状的放射性肺炎（≥Ⅱ度）。统计学发现与仅发生Ⅰ度放射性肺炎的患者相比，有症状放射性肺炎患者的NLR显著增加，多因素分析提示放疗后NLR大于6往往预示患者将发生有症状的放射性肺炎。

细胞因子由破碎细胞或炎症反应所释放，用以募集炎症细胞。来自美国的一项研究发现细胞因子作为正常组织放射性损伤生物标志物中的响应指标的可能性。例如，在一项入组接受胸部放疗的肿瘤患者的临床试验中，他们发现照射后发生有症状的放射性肺炎患者血浆中白细胞介素1α（interleukin 1α，IL-1α）以及白细胞介素6（interleukin 6，IL-6）的表达水平要显著高于那些未发生放射性肺炎的患者。而在另一项入组了96例接受胸部放疗的非小细胞肺癌患者的前瞻性临床试验中，研究者同样得出了相类似的结论，他们发现照射后发生放射性肺炎患者血浆中IL-6的水平要显著高于未发生患者，而多因素分析则进一步发现放疗开始后前两周内患者血浆中IL-6、IL-8的表达水平是发生放射性肺炎的独立响应指标。然而，与上述TGF-β1相似，同时期内一些设计类似的、同样入组接受放疗的非小细胞肺癌患者的前瞻性临床试验却得出了阴性的结果，即放疗后患者发生放射性肺炎以及放射性非纤维化的风险与血浆中IL-6等细胞因子的表达水平无关。由于除了宿主本身的间质细胞以外，肿瘤微环境中的免疫细胞，以及肿瘤细胞本身也同样能产生IL-6等细胞因子，因而目前认为这些“额外”产生的细胞因子，使得研究血浆中细胞因子作为预测正常器官放射性副反应风险的标志物的研究结果变得困惑。

在一项前瞻性临床试验中，研究者入组了48例接受三维适形放疗的非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）患者，发现放疗开始后两周患者血浆中TGF-β1表达水平即开始增加，并且发生放射性肺炎患者的血浆TGF-β1表达水平要显著高于未发生患者，这一研究结果提示血浆中的循环TGF-β1可以作为接受胸部放疗的患者发生放射性肺炎的独立响应指标。基于这些研究结果，一项临床试验根据患者血浆TGF-β1的表达水平来决定患者的照射剂量，该临床试验入组了38例局部晚期的非小细胞肺癌患者，使用超分割模式（单次量1.6Gy，每天照射两次）照射至73.6Gy，随后根据患者血浆TGF-β表达水平决定是否加量，最终，24例患者因血浆TGF-β表达异常而未接受加量，而在其余14例TGF-β表达正常的患者中，8例加量至80Gy，而剩余6例则加量至86.4Gy，最后通过对患者进行长达16个月的随访，该研究认为依据血浆中TGF-β表达水平决定非小细胞肺癌患者的照射剂量是可行的。然而，一些设计类似的临床试验却得出了不一致的结论，部分可能是由于肿瘤组织与正常组织均能产生TGF-β1，以及检测手段的一些问题。上述研究结果提示血浆中TGF-β1表达水平可作为预测放射性肺炎发生风险的生物标志物，当然其可靠性还需要设计合理的大样本量的前瞻性临床试验所证实。

糖蛋白KL6是一种黏蛋白样的大分子肿瘤抗原，主要由Ⅱ型肺细胞以及支气管上皮细胞产生，目前，血浆中KL6的表达水平已经被用作为临床上协助诊断间质性肺炎的生物标志物，而其诊断间质性肺炎的阈值为465U/ml。而有研究探讨了使用血浆KL6作为放射性肺炎响应指标的可能性。在一项临床试验中，研究者入组了29例接受辅助性外照射放疗的乳腺癌患者，他们发现其中4例发生放射性肺炎的患者其血浆中KL6蛋白的表达水平显著增加，而其余25例未发生放射性肺炎患者其血浆中KL6蛋白的表达水平则较低，提示了血浆中KL6蛋白表达水平可能同样适用于早期放射性肺炎的风险预测，然而，所有患者血浆中KL6蛋白的表达水平均未超过诊断间质性肺炎的阈值（465U/ml）。

目前已经得到证实，在暴露于电离辐射照射之后长达几天甚至几周的时间内，肺细胞持续向肺泡内释放表面活性剂（surfactant protein，SP-A，-SP-B，SP-C以及SP-D），并且照射造成的肺内皮细胞通透性的增加也会导致肺泡内的这些表面活性剂释放入外周血循环。而在一项来自于日本兵库神户医学院开展的临床试验中，研究者入组了86例接受胸部放疗的肺癌、乳腺癌以及食管癌患者，他们发现放疗后发生放射性肺炎的患者其血浆中表面活性剂SP-A与SP-D的表达水平会显著增加，具体来看，在放疗开始后3周（照射剂量约30~40Gy）时，这些患者血浆中SP-A与SP-D的表达水平开始增加，并且在放疗开始后五至六周（照射剂量约50~60Gy）达到顶点，相反，未发生放射性肺炎的患者其血浆中SP-A与SP-D的表达则未发生明显变化。在另一项同样研究血浆中SP-A与SP-D表达水平改变与放射性肺炎的临床试验中，研究者入组了25例接受放疗的肺癌患者，并且在放疗开始前、放疗结束后1周以及3周等时间点上分别抽取患者血液样本，尽管该研究发现不论是否发生放射性肺炎，放疗后患者血浆中SP-A与SP-D表达水平均会显著增加，进一步分析发现对于那些发生放射性肺炎的患者，其放疗结束后一周时SP-A与SP-D较放疗前升高的比例要显著高于那些未发生放射性肺炎的患者，并且接受激素治疗的放射性肺炎患者，其放疗结束后3周时血浆中SP-A与SP-D表达要显著低于放疗结束后1周，而未接受激素治疗的放射性肺炎患者，放疗结束后3周时血浆中SP-A与SP-D表达与放疗结束后1周相当，提示放疗前后动态检测患者血浆中SP-A与SP-D的表达改变或许可以预测患者发生放射性肺炎的风险。

细胞角蛋白是一种仅由上皮细胞表达的细胞骨架结构。其中，细胞角蛋白19主要表达于支气管上皮等单层上皮处，而血浆中细胞角蛋白19片段（CYFRA 21-1）已是目前临床上被普及的肺癌标志物，可以反应肺癌细胞的凋亡情况。由于目前认为在电离辐射引起的肺组织损伤的发病机制中，射线引起的Ⅱ型肺细胞凋亡可能起到重要的作用，而受损的Ⅱ型肺细胞可能将CYFRA 21-1释放入血，因而有临床研究探讨了患者血浆中CYFRA 21-1表达水平与放射性肺炎之间的相关性。该临床试验一共入组了16例放疗后发生放射性肺炎的肺癌患者，结果发现，6例发生弥漫性放射性肺炎患者血浆中CYFRA 21-1的表达水平要显著高于剩余10例仅发生局限性放射性肺炎的患者，此外，对于那6例发生弥漫性放射性肺炎的患者，研究者发现他们血浆中CYFRA 21-1的表达增加与病情的进展相关，由于CYFRA 21-1目前已被作为一种肺癌的肿瘤标志物而在临床上被广泛应用，因而这些证据进一步提示CYFRA 21-1可能也具有同时作为临床上预测放射性肺炎的生物标志物的潜能。

血栓调节素（thrombomodulin，TM）是一种跨细胞膜的内皮细胞糖蛋白，是机体生理条件下非常重要的抗凝剂，当机体发生炎症时，血栓调节素的表达水平即被下调并被释放入外周血循环。20世纪90年代美国开展的一项临床试验入组了17例接受放疗的肺癌患者，其中9例患者发生了放射性肺炎，而剩余8例则非发生放射性肺炎，他们发现对于那些发生放射性肺炎的患者，放疗开始后其血浆中血栓调节素的表达水平未发生明显改变，而未发生放射性肺炎患者在放疗开始后1至2周其血浆中血栓调节素的表达即出现显著降低，提示放疗开始后血浆中血栓调节素的表达水平的降低可能和较低的放射性肺毒性相关。

微小RNA（microRNA，miR）是包含约22个核苷酸的一类非编码单链小RNA，在进化上高度保守。MicroRNA主要通过抑制蛋白翻译或剪切信使RNA等方式调节下游目标基因的表达。由于单个microRNA往往可与数十甚至数百个信使RNA相互作用并调节后者的表达，因而在细胞增殖、分化、周期调控、凋亡等多种重要生理学过程中发挥关键作用。目前，已经证实microRNA存在于血浆、血清以及尿液等多种人体体液中，加之其具有高度稳定性、组织及器官特异性等特点，大量动物实验结果已经提示放疗后外周血中部分microRNA的表达水平会发生改变，并呈剂量依赖性。因而外周血循环microRNA已成为预测正常组织放射性损伤的潜在响应指标。在此基础上，一项临床试验入组了5例接受根治性放疗的NSCLC患者，研究者发现放疗后患者外周血中miR-29a-3p及miR-150-5p表达水平会显著降低，并与平均剂量、V₂₀等肺的剂量学参数相关。随后，研究者通过另外入组的21例NSCLC患者进一步证实了上述发现，提示外周血miR-29a-3p、miR-150-5p是预测胸部放疗后放射性肺炎的潜在生物标志物。另一项临床试验入组了多达101例接受胸部放疗的NSCLC患者。研究者发现放疗开始后1~2周内，发生严重放射性食管炎患者外周血中的miRNA-155、miR-21及miR-221表达水平会显著增加，而统计学分析则进一步提示放疗后miRNA-155与miR-221的高表达是患者发生严重放射性食管炎的危险因素。因此，外周血microRNA具备预测放疗后特性器官或组织发生放射性损伤风险的潜能。

对于腹盆部恶性肿瘤来说，放疗是十分重要的治疗手段之一。然而对于腹、盆部肿瘤的放疗来说，肠道的毒性反应是限制放疗应用以及剂量的最重要因素。并且随着肿瘤疗效的提高，越来越多的腹盆部肿瘤患者能被治愈并获得长期存活。瓜氨酸是一种谷氨酰胺被小肠上皮细胞代谢而生成的含氮终末产物，而血清中瓜氨酸的表达水平常常被用来评估小肠上皮细胞的功能，而小肠功能受损则会导致外周循环中瓜氨酸表达水平的降低，因而血浆中瓜氨酸的表达水平已经被临床上广泛用作评估化疗、手术以及其他条件下小肠功能受损的生物标志物。随后，一项临床试验入组了53例接受盆部外照射放疗的前列腺癌以及子宫内膜癌患者，通过分别在放疗前后不同时间点检测血浆中瓜氨酸的表达水平，同时结合小肠的剂量学、体积学参数以及临床症状，研究者探讨了使用血浆瓜氨酸表达水平作为预测放射性肠道损伤的生物标志物的可行性，结果表明放疗开始以后患者血浆中瓜氨酸的表达水平显著降低，且与小肠的受照射剂量以及肠道放射性毒性反应的严重程度均显著相关，提示基于血清瓜氨酸表达水平的评估手段可能可以作为预测患者放疗后发生放射性肠道损伤的风险及严重程度。在另一项临床试验中，研究者入组了32例接受清髓治疗（全身照射）并随后接受造血干细胞移植的血液肿瘤患者，研究发现这些患者血清中瓜氨酸表达水平开始降低伴随着患者肠道功能的受损。

健康成人的肠道系统大约寄居着400~500种细菌，统称为肠道菌群。肠道菌群已被证实在代谢、神经认知功能、心血管系统功能、血液系统功能、炎症与免疫以及肿瘤发生等多种生理、病理学过程中发挥着关键性作用，被称为人体的“第二套基因组”。最近研究结果证实，肠道菌群失衡在炎症性肠病的发生发展中也起着关键性调控作用。鉴于放射性肠道损伤与炎症性肠病存在许多相似性，因而近年来越来越多的学者开始关注肠道菌群失调在放射性肠道损伤发病过程中所起的作用。早在切尔诺贝利核事故后，研究人员就已发现受照伤员肠道内的细菌含量显著减少。随后，动物实验证实，与正常饲养小鼠相比，无菌小鼠（缺乏肠道菌群）的肠道能够耐受更高剂量的射线照射。在一项临床试验中，研究者入组了10例接受盆部放疗的肿瘤患者以及5例健康志愿者，发现与健康志愿者及放疗后未发生急性放射性肠道损伤（腹泻）的患者相比，放疗后发生急性放射性肠道损伤患者肠道菌群的多样性出现了较大变化，同时还包含较多的放线菌（Actinobacteria phylum）。在一项设计类似的临床试验中，研究者同样发现与放疗后未发生急性放射性肠道损伤的患者相比，发生急性放射性肠道损伤患者的肠道菌群在多样性、丰富度以及厚壁菌/拟杆菌比值（firmicutes/bacteroidetes ratio）等方面均有较大差异。此外，目前已有临床试验证实广谱抗生素治疗（消除肠道菌群）能够预防临床腹、盆腔放疗引起的肠道损伤。上述研究结果不仅揭示了菌群失调可能在肠道辐射损伤的发病机制中扮演着十分关键的角色，同时也提示肠道菌群可能具备作为放射性肠道损伤的响应指标的潜能。目前，基于16s rRNA测序技术对肠道菌群进行分类鉴定的手段已经成熟。但健康成人肠道内定植的细菌数量达到400~500种，总量达到10¹⁴个集落形成单位，故其检测结果必然十分庞大。因此，下一步必须利用生物信息学手段对堪称海量的肠道菌群检测数据进行归纳总结，才能真正建立可用于临床实践的基于肠道菌群的放射性肠道损伤早期诊断的生物标志物系统。