- 膀胱癌卡介苗免疫治疗原理与实践
- 韩瑞发 姚智
- 2983字
- 2020-08-28 07:10:04
第四节 蛋白丝/苏氨酸激酶抑制剂
蛋白丝/苏氨酸激酶(protein serine/threonine kinase,PSK)是哺乳动物体内分布非常广泛的蛋白激酶,种类繁多,作用广泛,其调节机制也很复杂。主要有cAMP依赖的PKA、cGMP依赖的cGPK、钙/磷脂依赖的PKC、钙/钙调蛋白依赖的CaMK以及MAPK。其中与免疫细胞信号转导密切相关的有PKC和MAPK。
一、蛋白激酶C抑制剂
目前在哺乳动物组织中已经确定了12种蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)亚型,都由一条多肽链组成,在结构上具有很大相似性。PKC分子中存在四个相对保守的区域,从N端到C端以此命名为C1~C4。C1是PMA和DAG的结合位点,C2是钙离子结合位点,C1和C2合称PKC的调控区。C3有一个ATP结合基序GxGxxGL,为PKC提供能量和磷酸基团。C4是底物结合区,与C3合称催化区。根据不同亚类的结构类型和功能特点,可将PKC分为三种类型:①Ca2+依赖型或传统(classical/conventional PKCs,cPKCs),包括4种亚型(α、βⅠ、βⅡ及γ),依赖于Ca2+、磷脂酰丝氨酸(phosphatidyl serine,PS)、DAG,还受到顺式不饱和脂肪酸和溶血磷脂酰胆碱的进一步激活;②Ca2+不敏感或新型(novel/new PKCs,nPKCs),包括5种亚型(δ、η、θ、ε及μ),其活化需要PS和DAG的存在,不需要Ca2+的参与;③非典型PKC(atypical PKCs,aPKCs),包括3种亚型(ξ、ι及λ),需要PS,不需要Ca2+和DAG。
PKC-α、β和θ是在T细胞和B细胞活化过程中发挥重要作用的PKC亚型,其中PKC-θ是T细胞活化时向免疫突触募集的唯一PKC。TCR活化后,经过Src家族激酶、Syk家族激酶及接头蛋白的级联活化,将PLC-γ募集到近膜区,在PTK的作用下发生酪氨酸磷酸化并活化。PLC-γ分解细胞膜磷脂成分PIP2产生IP3和DAG,其中DAG与PKC-θ的C2区域结合,促进PKC-θ活化。PKC-θ在多种转录因子的激活过程中发挥重要作用,其中包括NFAT。此外PKC-θ可通过活化Carma1-Bc110-Matl1复合物促进IκK活化,进而激活转录因子NF-κB。因此,开发PKC-θ特异性的抑制剂,可能为抑制机体免疫应答,为治疗自身免疫性疾病和移植排斥反应开辟新的道路。目前最重要的PKC-θ抑制剂包括两种:杂芳香吲哚马来酰亚胺衍生物(以AEB071为代表)和3-吡啶腈衍生物。
Wagner J等发现基于马来酰亚胺的PKC抑制剂(化合物2)具有C3和C4位置双吲哚结构(图1-10A),对C3位置的吲哚基团进行取代后得到化合物3~5,但是这些化合物的PKC抑制活性低于化合物2。接下来,研究者又对C4位置的吲哚基团进行了一系列取代,得到了化合物6~16和化合物1,其中化合物10、12和化合物1(图1-10B~D)对PKC-α、β和θ的抑制活性最强,并能够抑制T细胞经TCR/CD28途径的活化。化合物1可与PKC中Glu418及Val420形成氢键,使其能够结合于PKC的ATP结合槽内,化合物1远端哌嗪基团的N原子亦可与PKC催化环上的Asp476形成氢键,加之在疏水力的作用,化合物1与PKC能够牢固结合(图1-10E)。随后化合物1命名为AEB071,目前AEB071已经进入治疗移植排斥反应的Ⅱ期临床实验阶段。
图1-10 PKC-θ抑制剂
A.化合物2;B.化合物10;C.化合物12;D.化合物AEB071;E.AEB071与PKC结合模式图;F.化合物4p;G.化合物19;H.化合物23e;I.化合物13b
Matz M与Evenou JP等研究发现,AEB071可以显著抑制活化信号刺激状态下的T细胞PKCθ活性,选择性影响NF-κB和NFAT(而不是AP-1)信号传导途径。AEB071可显著抑制抗CD3/CD28单抗、抗原、IL-2、ConA和异体淋巴细胞诱导的T细胞活化增殖,抑制活化T细胞ICOS、CTLA-4、CD71、CD25、CXCR3、Ox40、CXCR3和PD-1的表达,但不能抑制CD69的表达。AEB071可显著降低活化T细胞IL-2和IFN-γ的分泌,抑制Mo-DC细胞的成熟及共刺激分子CD40、CD80、CD86的表达,降低Mo-DC诱导T细胞活化的能力,还可抑制NK细胞的杀伤活性。因此,AEB071作为一种新型的免疫抑制剂,在器官移植、自身免疫型糖尿病、银屑病的治疗领域内具有广阔的发展前景。
近年来,3-吡啶腈衍生物类PKC-θ抑制剂的研究也取得了丰硕成果,其中抑制活性最强的四种化合物如图1-10F~I所示。化合物4p(图1-10F)是4-芳胺基-3-吡啶腈衍生物,化合物19和23e为5-乙烯基-3-吡啶腈衍生物(图1-10G、H)。化合物13b,为5-苯基-3吡啶腈衍生物(图1-10I)。四种化合物抑制PKC-θ 的IC50依次为70nM、4.7nM、1.8nM和7.4nM。化合物4p可抑制TCR/CD28信号介导的T细胞活化及IL-2分泌。
二、MAPK家族激酶抑制剂
丝裂酶原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一种可以被多种细胞外信号激活的蛋白丝/苏氨酸激酶,处于胞浆信号转导通路的终末端位置,活化后转位到核内,作用于核内转录因子,调节基因表达。目前已经报道的哺乳动物的MAPK亚型已超过20余种,其中研究最为广泛的三组成员是ERK1/2、p38MAPK和JNK。尽管三个成员分布广泛,功能复杂且有交叉,但也存在着一定分工:ERK1/2对于细胞增殖至关重要,是多种生长因子受体胞内信号传导的参与者,P38MAPK主要参与炎症反应和促炎性细胞因子的分泌,而JNK又称为应激激活的蛋白激酶(stress activated protein kinase,SAPK),在应激和炎症反应中发挥重要作用。
(一)JNK激酶抑制剂
JNK信号传导牵涉很多慢性免疫相关性疾病,比如RA、糖尿病、动脉粥样硬化、阿尔兹海默病、帕金森病等,因此JNK成为了这些疾病有价值的治疗靶点之一。针对JNK与支架蛋白JNK相互作用蛋白1(JNK-interacting protein-1,JIP1)相互作用的多肽类抑制剂pepJIP1(氨基酸序列为RPKRPTTLNLF)虽可抑制JNK的活化,但是其跨膜转运效率及代谢稳定性较低,不利于临床应用。Stebbins JL等通过高通量筛选得到了小分子化合物BI-78D3,以及此基础上衍生得到的BI-87G3和BI-87D11,通过与JNK竞争性结合阻断JNK的作用(图1-11A~C)。
图1-11 JNK抑制剂
A.BI-78D3;B.BI-87G3;C.BI-87D11;D.化合物9;E.BI-98A10
Pellecchia M等以BI-78D3为参考,合成了一系列小分子的JNK抑制剂,其中活性最强的是化合物9(图1-11D)。化合物9的硝基噻唑基团可与JIP结合位点的Arg127及Cys163结合,发挥与pepJIP1相似的作用,阻断JNK的活化,IC50为0.7μM。Pellecchia M等最近又合成了一批JNK小分子抑制剂,其中活性较高的化合物为BI-90H6、BI-90H9、BI-90H10和BI-98A10。这些化合物活性最强的为BI-98A101,IC50为3μM,低于BI-78D3(图1-11E)。
(二)P38MAPK激酶抑制剂
p38MAPK通路在炎症和应激条件下可被强烈激活,对于炎性细胞在炎症部位的聚集及促炎性细胞因子(如IL-1β和TNFα)的释放均发挥重要作用,近年来,新型的p38MAPK小分子阻断剂包括VX-702、SB706504、BIRB796、ORG48762-0、FR167653、VX-745、AMG548和pamapimod等不断被研发生产。此类药物多用于RA或Crohn病等自身免疫性疾病的治疗。
多种ATP竞争抑制型p38 MAPK抑制剂都是由典型的嘧啶-4-咪唑类化合物SB203580衍生而来。此类化合物能与ATP结合槽发生作用,关键在于以下4方面:①2-氨基吡啶残基于p38铰链区形成氢键;②亲脂的芳香基团与ATP结合槽内疏水口袋后方区域结合;③与ATP结合槽内疏水口袋前方区域结合;④进一步与糖基口袋及磷酸盐结合区域结合(图1-12)。
图1-12 ATP与p38 MAPK结合示意图
由Scios公司开发的p38MAPK抑制剂SCIO-469(图1-13A),属于吲哚酰胺类衍生物,对P38MAPKα具有很高的选择性。结构预测分析显示,SCIO-469的C5羰基可能和p38的Met109以氢键连接,疏水性的苄基哌嗪占据p38激酶的作用位点,从而抑制p38的激酶活性。SCIO-469对促炎性细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌具有一定抑制作用,并能抑制机体炎症反应。一项有302例活动期类风湿关节炎患者入组的为期24周的临床试验已经结束,但试验结果显示SCIO-469对该类型类风湿关节炎无明显治疗作用。
图1-13 p38MAPK抑制剂
A.SCIO-469;B.SB203580;C.PH-797804;D.AW-814114;E.ML3043
SB203580(图1-13B)可模拟ATP与p38结合,抑制p38MAPK活性,抑制子宫内膜异位模型小鼠腹膜细胞IL-1β、TNF-α、MMP-2和MMP-9的蛋白及mRNA表达水平,减轻模型小鼠子宫内膜异位损害。辉瑞公司合成的PH-797804(图1-13C)是一种ATP竞争性p38MAPK抑制剂,可结合于p38的ATP结合位点。体内实验证实,PH-797804可抑制促炎性细胞因子IL-6和TNF-α的分泌,抑制内毒素和LPS引起的慢性炎症反应,缓解大鼠AA和小鼠CIA的症状,减轻关节损伤。Chopra P等合成的p38 MAPK抑制剂AW-814114(图1-13D)可抑制LPS诱导的人外周血单个核细胞TNF-α的表达,抑制小鼠CIA模型的进展。ML3043(图1-13E)可与p38α MAPK结合,抑制p38 MAPK诱导的呼吸道平滑肌细胞分泌促炎性细胞因子IL-6和IL-8,降低呼吸道炎症反应。