第六章　胆管细胞分泌的调节

40年前人们发现激素分泌素通过与胆汁酸转运的不同机制来刺激胆汁流量和胆管分泌物的增加。随后，人们发现分泌素受体位于胆管细胞，在人类这些受体的活化将使胆汁流量成倍增加，从0.67ml/min增加到1.54ml/min，同时可增加胆管浓度，从37mmol/L增加到43mmol/L。因为胆管细胞不仅体积很小（直径约10μm），而且数量也有限（约占肝脏的2%～5%），这表明胆管细胞有显著的分泌能力。

一、胆管细胞Cl-的转运

肝脏胆汁的形成取决于肝脏的实质细胞肝细胞和胆管细胞的相互作用，这些胆管细胞排列于肝内胆管的内腔。这些不同的细胞通过不同的机制调节胆汁流量。在肝细胞内，胆汁形成首先是从胆汁酸、谷胱甘肽和其他有机溶质转运进入肝细胞之间的毛细胆管间隙开始。这是一种活跃的需要能量的过程，可导致牛磺胆酸酯及其他溶质在胆汁内浓缩，其比窦状血中的浓度高100倍，所形成的渗透梯度有利于水分移至毛细胆管内。接着，毛细胆管内的胆汁流入肝内细胆管内，在此处胆汁碱化和稀释，导致胆管细胞分泌Cl-和区别于肝细胞的是，胆管细胞表现为极性的上皮单细胞层。胆管细胞的结构特征包括：①分化好的顶层和基底外侧的区域，分别约占细胞表面的57%和43%；②突出的顶侧微绒毛和侧膜齿状交错，可增加表面和体积比例；③细胞间电紧密连接复合体具有足够的电阻（大于1000Ω/m2），这使得顶端和基底外侧区域在功能上分离。

这些结构特征是气道、肠以及其他将氯离子跨上皮转运作为分泌主要动力的上皮细胞的特征。在肝内胆管不同部分，分泌素刺激可增加水转运至管腔，但这一过程必须需要Cl-和同时参与。在基础情况下，基底外侧膜内的Na+/K+/2Cl-（或相似的蛋白质）可引起细胞内Cl-积聚直至高于电化学平衡值。但是Cl-顶膜的渗透能力很低，使得Cl-向细胞外移动最小而进入小胆管腔。应用分泌素和增加细胞内cAMP物质可引起一系列反应，包括：①许多含通道囊泡的运动；②顶膜囊性纤维化跨膜调节因子（CFTR）Cl-通道的开放以及Cl-向细胞外流出进入胆管腔；③阴离子交换子3（AE3）介导交换活性的增加；④通过水通道水向细胞外转运。另外，通过Na+/K+/ 2Cl-基底外侧膜的K+通道使K+进入再循环，以维持内侧阴离子驱动力使Cl-分泌。这种网络效应导致顶膜Cl-的通透性增加，使得Cl-向细胞外和胆管腔内快速转运，同时有交换活动的增加。因此，Cl-跨上皮转运是胆道细胞进行分泌的原动力，而且顶膜的Cl-通道是分泌调节的关键部位（图6-1）。

二、囊性纤维化跨膜调节因子是一种cAMP调节的Cl-通道

在由胆管细胞表达的不同离子通道类型中，人们对CFTR的了解比较多，似乎可解释顶端Cl-分泌中分泌素刺激的增加。CFTR是ATP结合盒（ABC）超家族蛋白的成员，在活体内是一种磷酸化蛋白。另外，通过cAMP依赖的蛋白激酶A（PKA）的磷酸化可引起顶端Cl-分泌增加，目前认为至少通过两种机制发挥作用。首先，PKA可增加膜上通道的开放。在分离的细胞膜片段，用重组PKA干预细胞膜表面可引起Cl-选择性通道开放，其整体气传导率大约10pS，其与CFTR的生物物理学特征相一致。在单细胞水平上，这种网络效应可使膜Cl-通透性增加5倍。其次，越来越多的证据显示cAMP可以调节囊泡的转运以及引起离散的含通道小囊泡的归巢。因此，如果这些囊泡包含CFTR，那么胞吐作用将增加细胞膜上CFTR蛋白的量。相应地，对特异性生理信号的反应可使胞膜内CFTR通道的数目发生变化。

三、顶端转运蛋白的囊泡内转运

一些资料表明小囊泡转运在调节胆管细胞分泌反应中起重要作用。首先，140～200nm小囊泡密集于顶膜下区域，其与肌动蛋白细胞骨架有密切的联系。其次，这些囊泡组成和调节顶膜的转运功能。有研究显示荧光染料FM1-43可用作探针实时监测细胞外吐作用，因为：①FM1-43在溶液中显示微弱的荧光，但是在与膜结合时荧光强度增加大约350倍；②与膜结合而非穿透膜。因此，总荧光强度和膜上的染料量相一致。当荧光染色细胞膜时（100%），荧光随着暴露FM1-43而快速增加。如果没有细胞的胞吐作用，荧光强度将维持稳定。然而，荧光强度的持续增加反映胞吐作用以及新膜暴露于FM1-43。依大小评估，每分钟约有600～800个囊泡胞吐。此外，为维持细胞大小的稳定也有相等量的细胞内吞作用。

重要的是，囊泡的运输一部分被cAMP调节，可使胞吐率增加至每分钟1400个或更多囊泡。间接观察表明这不仅仅是由于这些小囊泡构造池转运率的简单增加，而是通过一种依赖肌动蛋白机制使分散的cAMP反应囊泡快速归巢。因此，越来越多的证据表明胆管细胞拥有一群相当大的囊泡，这些囊泡可被cAMP调节，在几分钟内可取代大部分细胞膜。

分泌素刺激的囊泡富含水通道和CFTR蛋白，胞吐的刺激可以引起这些蛋白质由细胞内部到顶膜快速再分布。相应地，这种全身性的反应过程常会影响转运蛋白的数量和类型，随细胞决定域的转运特性发生改变。目前有关胆管细胞内囊泡的转运机制尚不太清楚，尚需进一步阐明。

四、细胆管分泌的非cAMP依赖性调节

胆管细胞表达一个大范围的其他受体类型，这些受体决定胆汁转运和分泌的正相和负相调节。例如，蛙皮素、血管活性肠肽和ATP可刺激胆管细胞的分泌反应，这种反应等同于或超过由分泌素引起的反应，但这种效应不直接依赖于细胞内cAMP水平的变化。

有三点需要强调：①细胞内传导途径或不依赖cAMP的分泌反应的细胞内机制目前了解得不多。乙酰胆碱能够增强分泌素或cAMP反应表明也存在共同通路，但是在很多情况下这些反应不依赖CFTR和cAMP。②越来越多的研究表明，胆汁内的一些因子可以调节分泌。与集中在基底外侧的分泌素受体相比，P2 purinergic受体出现于顶膜处，而受体激动剂ATP存在于胆汁内，达到一定浓度可刺激大的分泌反应发生。肝细胞毛细胆管膜释放的ATP可作为自分泌或旁分泌因子发挥作用，协调单个肝细胞和胆管细胞的分泌。③因为氯离子通道表示调节分泌物的中心目标，除了CFTR以外，其他通道与不依赖cAMP的反应有关。在单个细胞水平上，细胞体积与细胞质中钙离子浓度的增加可以增加氯离子流密度（以pA/pF测定）以到达或超过cAMP刺激的水平。此外，这些电流的生物生理学特征差异表明CFTR通道不可能有关联。

胆管细胞体积增大和某些蛋白激酶可激活氯离子通道。胆管细胞具有强的代谢和转运能力。在生理（如溶质吸收的动力学变化）和病理状况（如局部缺血、ATP缺失及炎症）下易受到细胞肿胀的影响。尽管如此，但在大多数情况下，细胞体积维持在一个比较窄的生理范围内。细胞体积的增加可伴随蛋白激酶易位至质膜，同时可激活钾、氯离子通道。随之溶质外流使水易向细胞外转移，使细胞体积恢复到基线水平。值得注意的是，氯离子通道一旦被阻碍就会抑制细胞体积肿胀后的恢复，同时减少低渗培养基中细胞的生存。另外，细胞体积的增加可作为生理性刺激因子，可增加顶端氯离子的渗透和跨上皮氯离子的分泌，提示细胞体积本身可作为胆管细胞分泌性刺激因子。体积敏感的信号传导途径有：①通过磷酸肌醇（PI）-3激酶依赖机制刺激局部ATP的释放；②在细胞膜内激活P2受体。在其他的一些细胞中可见P2受体刺激含氯离子通道的小囊泡插入。CFTR和尚未确定的体积敏感的氯离子通道存在于不同的囊泡内，这些小囊泡根据生理变化需求能够选择性发生变动。

由Ca2+/钙调节蛋白依赖性激酶活化和Gi抑制的其他的氯离子通道也存在于胆管细胞内，但它们的细胞定位和生理功能仍然不十分明了。已经证实Ca2+活化的氯离子通道表达是囊性纤维化发生的重要决定因素。因此，当cAMP调节的Cl-分泌缺陷时，存在Cl-分泌的替代途径将使有害作用降至最低。

五、未来的研究方向

有关胆管细胞分泌的调节，下列几点需要重视。首先，对与CFTR不相关的氯离子通道的分子机制知之不多。编码CIC-2 Cl-的通道已从胆管细胞分离出，通过不同的技术已证实其mRNA和蛋白的表达，但对其作用还有争议。值得注意的是，在有些类型的上皮细胞内，CIC-2通道可由体积增加来激活，细胞内对CIC-2必需调节域抗体的转运可减少体积变化敏感的电流，且可延迟已膨胀细胞体积的恢复。因此CIC-2通道可作为胆管细胞中对细胞体积变化敏感通道的补充。然而克隆的CIC-2通道的生物生理特征和内源性的容积敏感传导有显著的不同，因此，CIC-2通道能够和其他阴离子通道一起行使功能或者根据调节的方式改变通道的特性。其次，在Cl-分泌反应和小囊泡转运之间有紧密的联系。有关分离囊泡池的选择性补充或恢复，或者既补充也恢复的机制了解不多。很可能有细胞外因子（例如蛋白激酶PI-3、肌动蛋白）以及更多特异性含通道的靶囊泡作为共同信号（例如cAMP）。此外，在胞吐作用、内吞作用以及细胞区域之间的细胞机制尚不太明确。最后，极其重要的是应用这些结果开发新的药物来治疗这些胆管疾病。在各种损伤性胆道疾病中，胆管细胞是一种重要的靶细胞，但目前还没有有效的方法来增加胆汁的分泌和胆汁内重碳酸盐的含量。因此开发对胆管细胞有选择性靶向的受体或通道的激动剂有非常大的应用前景，但目前此方面的进展尚有限。开发出的这些药物将来可用于治疗胆汁淤积性肝病、胆石症和囊性纤维化等。

（王晖　陆伦根）

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