第五章　胆管细胞功能的异质性

一、肝内胆管系统形态学异质性

（一）解剖学

肝内的胆管上皮组织由不同大小的胆管相互连接组成一种三维的网状结构。这种胆管系统包含从闰管到肝内外不同的胆管。在人的肝脏中，肝内胆管上皮组织根据胆管的大小可分类为：毛细胆管（直径小于15μm）、小叶间胆管（直径为15～100μm）、间隔胆管（直径为100～300μm）、区域胆管（直径为300～400μm）、节段导管（直径为400～800μm）和肝导管（直径大于800μm）（表5-1）。近来，在观察到不同大小的导管功能不同的基础上，将大鼠肝中的肝内胆管分为小导管（直径小于15μm）和大导管（直径大于15μm）（表5-1）。

胆汁最先在毛细胆管（由相邻的肝细胞形成）中被分泌，然后通过闰管运输到细胆管。胆汁接着流向大一些的胆管，在那里，胆汁再被重吸收和分泌，最后进入十二指肠。

（二）血管生成

肝内和肝外胆管由毛细血管网〔胆管周围血管丛（peribiliary vascular plexus，PVBP）〕提供营养。胆管周围血管丛起源于肝动脉分支，然后主要流进肝血窦，或直接通过小叶分支，或通过门静脉分支（前小叶分支）。最近对大鼠的研究表明，大胆管和小胆管有着不同的血管供应。尽管在大胆管周围可以观察到精细的胆管周围血管丛，但是在小胆管周围血管结构不易见，因为血管丛在比例上比胆管还要小。由于血流的方向与胆流的方向相反（如从大到小的胆管），胆管周围血管丛为胆汁重吸收物质进入肝细胞的反相流通系统。在大鼠胆管结扎（BDL）导致的胆管细胞增生中，胆管周围血管丛同时也显著地增生，以提供给增生的胆管细胞更多的血液供应和营养，以维持正常的功能。在BDL介导的增生后，在大胆管周围可发现胆管周围血管丛增生，因为在大鼠模型中只有大胆管增生。

二、小胆管和大胆管形态学特征

在人肝中，小胆管由4或5个胆管细胞排列，连接到小叶胆管。小叶胆管的横切面直径为20～100μm。随着胆管的增大，胆管细胞也逐渐变大，并且在形状上越来越圆。这些表明大的胆管由大的胆管细胞排列组成，小的胆管由小的胆管细胞组成，因此，小的（直径小于15μm）和大的（直径大于15μm）肝内胆管单位（IBDU）以及小的（直径大约8μm）和大的（直径大约15μm）胆管细胞在肝内胆管中有不同的特定功能（图5-1）。尽管大鼠和人的肝内胆管在解剖学上的关系还不十分明确，但在小鼠中的小胆管可能与人的小胆管相对应，而大胆管可能与小叶胆管相对应。

与人的肝脏情况相似，通过透射电镜研究表明大鼠大胆管由8～15个胆管细胞排列组成，而小胆管由4～5个胆管细胞组成。这些研究表明大和小胆管细胞都存在多小叶细胞核；含有小囊泡中高密度的胆管细胞位于表面下方区域，且线粒体数目少。紧密连接、大量微绒毛和溶酶体同样存在于小和大胆管。大胆管细胞呈圆柱状，而小胆管细胞近似于立方状。在大鼠肝中，肝内胆管上皮组织由不同大小的胆管和胆管细胞形成，胆管外径为5～100μm，胆管细胞的面积大小不等。胆管细胞的面积和胆管直径的大小之间有着重要的联系。这些发现显示在大鼠大胆管细胞中，高尔基体发达，它位于顶点和细胞核之间。在大胆管细胞中，可发现大量游离核蛋白体，粗面内质网并不丰富，滑面内质网几乎见不到。尽管大胆管细胞有较少的细胞核和明显的细胞质，但是在小胆管细胞中细胞核和细胞质的比率更高。在小和大胆管细胞中可观察到细胞核与细胞质的比率不同，这可解释大和小胆管细胞功能上的差异。在小胆管细胞中存在更大的细胞核（合成信使RNA的地方）和少量细胞质，表明小胆管细胞可能是无差别的基元细胞。大胆管细胞（有更多的细胞质区域，即RNA转运发生的地方）由多种有差别的细胞组成，大胆管细胞能合成膜受体、转运子和通道，也能与激动剂（如胰泌素）起反应。

三、胆管细胞功能基础

肝细胞分泌胆汁进入毛细胆管后，在到达小肠之前，胆管细胞通过一系列调节如重吸收和分泌过程来形成胆汁。胆管细胞影响胆汁组成，由许多因素调控，包括副交感神经、胃肠激素（如胰泌素、胃液素、促生长素抑制素和肠血管活性肽）、肽类［如内皮素-1（ET-1）］和胆盐等。在调节胆管分泌中，胰泌素是一种特别重要的物质，因为：①在大鼠肝脏中，它的受体（SR）只在胆管细胞中表达；②胰泌素刺激3′，5′-环磷酸腺苷（cAMP）产生，并且随胆管细胞增生而刺激胆管碳酸氢盐分泌上调。与此相反，胆管发育不良伴随SR表达的阻滞和胰泌素刺激的胆管分泌活性降低。因而，SR选择性调节胆管而不是肝细胞的分泌活性（因为SR只在大鼠胆管细胞中表达），在胆管细胞增生或损伤的病理生理学条件下，它上调或下调很重要。

胰泌素与碳酸氢盐分泌受体相互反应刺激胆管碳酸氢盐分泌，将导致细胞内cAMP水平增加。cAMP水平增加将诱导蛋白激酶A的活性增加，导致cAMP依耐性氯离子通道开放〔如囊性纤维化跨膜调节蛋白（CFTR）〕，随后激活顶膜的氯离子/碳酸氢根离子交换子和碳酸氢根的分泌。在另一方面，促生长素抑制素通过与生长抑素受体2受体作用以降低cAMP的水平来抑制胰泌素刺激的胞吐作用和胆管的分泌。同样，胃泌素也可抑制胰泌素刺激的胆管分泌和cAMP水平，通过激活和钙离子依赖性蛋白激酶Cα膜转运。

在正常情况下，胆管细胞的有丝分裂静止。但在慢性胆汁淤积性肝疾病时，有胆管细胞增生或缺失（胆管缺少），此时胆管细胞存在有丝分裂。在人肝脏中，在肝外胆汁梗阻时胆管细胞增殖。在慢性胆汁淤积性肝疾病（如原发性硬化性胆管炎、原发性胆汁性肝硬化、肝移植排斥反应和移植物抗宿主病等）以及酒精、毒物和药物性肝病中可发现胆管细胞的增生。在动物模型中，胆管细胞增生可通过许多病理方法诱导，如部分肝切除术、BDL和长期喂食特定胆盐食物，如牛磺胆酸（TC）和牛磺石胆酸（TLC）或毒性α-萘硫氰酸（ANIT）。在给正常或BDL大鼠急性注射四氯化碳后，特定大、小胆管可发生短暂的胆管细胞缺失。

四、评估胆管细胞异质性的体内和体外试验工具

体内模型评估胆管细胞功能的异质性特别重要，因为这些模型可诱导胆管细胞增生。可仅发生于特定胆管（如BDL大鼠中，仅出现于大胆管而不是小胆管），或发生于大和小胆管（如部分肝切除术，长期喂食特定牛磺胆酸、牛磺石胆酸或毒性α-萘硫氰酸的大鼠。而且，对胰泌素反应的大胆管损伤（直径大于15μm）可导致随后小胆管细胞的增生和分泌能力代偿性增加（如立即注射四氯化碳后），这些小胆管细胞在正常情况下有丝分裂是静止的且对胰泌素无反应。体外试验工具的发展使我们能够从肝内胆管上皮不同部位分离小胆管细胞和大胆管细胞亚群，或小的和大的IBDU，并且能详细说明肝内胆管细胞形态学上的异质性、对胃肠激素和肽的分泌应答，以及在肝损伤或毒素反应时的增殖和凋亡能力。

五、其他上皮细胞的功能差异

在肾脏中，大鼠的肾脏细胞形态学上有异质性并表现出不同的功能。例如，肾单元对氨、骨桥接素、水和钠的转运能力有功能上的差异。近端小管和髓袢的降支通过水孔蛋白水通道调节上皮细胞转运水的能力。小肠和大肠上皮细胞也有异质性，主要是其微绒毛长度的不同以及与吸收和分泌相关的膜转运体分布不同。门管周围和中央静脉周围的肝细胞对氧化供能、碳水化合物、氨基酸、胆汁酸和脂肪等代谢有差异。在部分肝切除后，门管周围的肝细胞比中央静脉周围的肝细胞增殖更明显。

六、肝内胆管上皮细胞生化和生理学异质性

（一）大胆管细胞

在小鼠、大鼠和人的大胆管和小胆管中，酶、膜转运体或受体的表达上的多样性见表5-2。在大鼠中，大胆管表达碱性磷酸酶和γ-谷氨酰转肽酶。有研究显示碱性磷酸酶在大胆管而不是小胆管中表达，并证实碱性磷酸酶通过阻断跨膜转导调节蛋白的活性来抑制胰泌素刺激的胆管分泌，而跨膜转导调节蛋白只在大胆管表达。在普通患者和肝外胆管阻塞的患者，肝节段区域、大间隔胆管和胆管周围腺表达胰酶（胰脂肪酶、胰淀粉酶、胰蛋白酶），这些酶被分泌到胆管腔。在人肝脏中，血液唾液酸lewis抗原主要在大间隔胆管中表达。

最近研究大鼠肝脏时，发现只有大胆管有以下特征：①表达胰泌素和生长抑素（SSTR2亚型）的基侧受体、跨膜转导调节蛋白、Cl-活性和Cl-/HCO3-交换体；②随胆管分泌的改变，对这些激素产生生理性应答。一些研究表明只有大胆管细胞分泌可增加cAMP的水平。在BDL大鼠中，生长抑素只在大胆管细胞抑制胰泌素刺激胆管分泌，因为大胆管细胞在肝中可唯一同时表达胰泌素和生长抑素受体。同样，在BDL大鼠中，内皮素（受体为ETA和ETB，同时在大和小胆管细胞中表达）可抑制胰泌素刺激胆管分泌。研究人的肝脏，发现Cl-、Cl-/HCO3-交换体只在小胆管中表达。特殊的胆盐（如TC和TLC）可以刺激大胆管细胞基底和胰泌素刺激胆管分泌，这些盐通过顶点的钠离子依赖性胆酸转运体（ABAT）进入细胞，ABAT只在大胆管细胞而不在小胆管细胞中表达。

综上所述，大胆管细胞是一种分化良好的功能性细胞，能够吸收、分泌和转运水和电解质。

（二）小胆管细胞

在小鼠肝脏中，肝内小胆管可表达锚定蛋白Ⅴ。因为在小囊泡转运和细胞凋亡中，锚定蛋白Ⅴ参与细胞骨架的重建。这个发现表明小胆管可能参与分泌现象（通过与胰泌素不同的机制），而且比大胆管对于肝损伤和毒素诱导的细胞损伤具有更好的耐受性。为了支持这种观念，最近研究表明在人正常肝脏和人肝硬化与肝局灶性结节增生的肝脏中，发现小胆管和小胆管可表达抗凋亡蛋白Bcl-2。

与大胆管细胞相比，在小胆管中，小胆管细胞不表达胰泌素或SSTR2促生长素抑制素受体或ABAT，且其对这两种激素或胆盐都没有生理性应答。这些研究表明，小胆管细胞可能是原始的未分化完全的细胞或是一种不活泼的胆管结构，这种结构将胆汁从小胆管传输到产生激素应答的大导管，然后运输到小肠。但是，与这种观念相反的是，一系列的研究表明小胆管细胞可能参与调控肝内胆管上皮细胞的分泌、增生和凋亡。在一些病理情况下，如损伤和对激素应答的大胆管失去增生和分泌能力时（如应用急性四氯化碳或长期喂食ANIT），小胆管细胞具有了分泌和增生的能力，从而代偿大胆管的功能。而且，长期喂食TC和TLC将诱导小胆管细胞重新表达ABAT和增生活性以及对胰泌素刺激分泌的能力。在正常情况下，小胆管细胞不表达ABAT并且对胰泌素也无应答，并且有丝分裂处于静止。在生理条件下，小胆管细胞表达内皮素的受体ETA和ETB，内皮素是一种通过激活细胞内钙离子来发挥其活性的肽类物质。最近有研究表明，小胆管细胞表达M3胆碱能、α1-肾上腺素能、D2多巴胺和胰岛素受体。因为胆碱能、肾上腺素和D2多巴胺激动剂和胰岛素通过激活钙离子来显示活性，小胆管细胞参与胆管的分泌活动，主要是通过钙离子调节途径而独立于大胆管细胞的胰泌素途径（如cAMP/PKA/CFTR/CL-/HCO3-交换子）。基于这些发现，有学者推测在肝内胆管上皮细胞中，小胆管和大胆管细胞是一种梯度分泌，小胆管（上游）通过钙离子依耐性通道分泌水和电解质，而大胆管通过cAMP/PKA/CFTR/CL-/HCO3-交换体分泌胆汁。但尚需更多的研究加以证实。

七、小胆管和大胆管对损伤或毒素和饮食疗法的增生和凋亡反应的异质性

在肝内胆管上皮细胞中，有特殊的增生和凋亡反应（如在小胆管和大胆管），它们对于损伤（如BDL和部分肝切除）、肝毒素（如四氯化碳和ANIT）或饮食疗法（如喂食胆盐）有着不同的反应。在大胆管中，BDL后大胆管细胞进行有丝分裂，大胆管和小胆管细胞都参与胆管上皮细胞的再生。BDL和部分肝切除不导致胆管细胞凋亡。对于BDL小鼠或正常小鼠，给予单剂量的四氯化碳将导致对胰泌素应答的大导管损伤（凋亡），伴随着胆管细胞分泌和增生能力的丧失。而小导管的胆管细胞对四氯化碳耐受性更强，可通过重新分泌和增生来代偿失去的大胆管功能。两者的反应不同可能与细胞色素P4502E1有关，这种酶在大胆管细胞而不是小胆管细胞能激活四氯化碳的肝损害。长期喂食ANIT将导致大胆管细胞和小胆管细胞凋亡，伴随着大胆管细胞增生活性增加，以及小胆管细胞重新开始增生。同样，长期喂食TC和TLC能刺激大胆管细胞和小胆管细胞增生，与喂食ANIT相比，没有凋亡发生。

小胆管细胞和大胆管细胞对肝的损伤或毒素有不同的反应。最近的研究表明不同大小的胆管上皮细胞表达不同的γ-GT、氨基磷酸酶、亮氨酰氨基肽酶。在BDL大鼠的小叶间隔胆管中，胆管细胞可表达Ⅱ相酶如UDP-葡萄糖醛酸转移酶和谷胱甘肽-S-转移酶）而不表达Ⅰ相酶，这可以解释胆管细胞对有致癌性和肝毒性的化学物质有更高的耐受性。

小胆管和大胆管细胞对于损伤和毒性物质反应（伴随有增生和凋亡变化）不同的机制目前还不明了。事实上，Ⅰ相〔如细胞色素P450、氨基吡啶-N-去甲基酶、葡萄糖-6-磷酸化酶、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADPH）、细胞色素还原酶〕和Ⅱ相〔如还原型谷胱甘肽（GSH）过氧化物酶、尿苷二磷酸（UDP）葡萄糖醛酸转移酶、谷胱甘肽-S-转移酶〕药物代谢酶在胆管细胞有不同的表达，这可解释胆管细胞为何对于药物或毒素或致癌物有不同的耐受性。同样推测雌激素可能在胆管细胞也有不同的反应。有研究表明，雌激素可维持胆管细胞的增生，β雌激素受体只在增生的胆管细胞亚群中有高表达，尤其是在BDL后的大胆管细胞和部分肝切除后的大胆管细胞和小胆管细胞。此外，不同的血液供给可能对大胆管细胞和小胆管细胞有不同的反应。有研究发现：①胆管细胞可分泌血管内皮生长因子（VEGF）；②胆管细胞表达flt-4和flk-1（而不是flt-1）；③VEGF只在BDL大鼠大胆管细胞增生的情况下才表达增加。

八、胆管上皮细胞病变的异质性

先天和后天慢性胆汁淤积性肝病都会累及肝内和肝外的胆管上皮细胞，所致的疾病称为胆管性疾病。胆管病累及不同的胆管上皮细胞，导致特定大小胆管的破坏和损伤。原发性胆汁性肝硬化（PBC）和原发性硬化性胆管炎（PSC）尽管这两种疾病在临床上并不常见，但在所见的胆管性疾病中是最为常见的两种疾病。PBC和PSC的发病机制与免疫异常造成的胆管上皮细胞的损害有关，器官移植后的异体排斥和移植物抗宿主病也与这两种疾病的发生和发展有关。

（一）大胆管疾病

PSC是最常见累及大胆管的胆管性疾病。它的临床特征是胆管树的进行性阻塞和纤维化以及胆管周围的纤维化，导致胆汁淤积，胆管硬化，最终导致肝衰竭。在内镜下逆行胰胆管造影显示，PSC显示典型的特征包括多发性胆管环形狭窄，兼有正常或轻度扩张的胆管，短束带状狭窄，憩室样局部扩张，故有串珠状改变。在更小的胆管也发现一种所谓的“小胆管PSC”，约占病例的15%左右。

胆管闭锁导致大胆管的坏死性炎症和损害，可能是由于形态学改变和感染或毒性物质，同时还有基因或免疫易感性，最常见于新生儿和儿童肝脏移植后。

大的肝外和肝内胆管是胆管癌常发生的部位，大约60%～80%的胆管癌发生在门管周围区域（Klatskin瘤）。有趣的是，PSC是主要的危险因素。在美国和欧洲，PSC患者中这种肿瘤的发生率为5%～15%。尽管发现了一些相关因素如P53蛋白的过度表达，k-ras和DPC4基因的突变等，但是有关胆管癌的发病原因目前还不明确。

（二）小胆管疾病

累及近端区域胆管上皮细胞而导致的胆管性疾病主要改变小叶胆管和间隔胆管的功能。如PBC累及小叶胆管和间隔胆管，可出现大量的T淋巴细胞和浆细胞的炎症细胞浸润。非化脓性的胆管炎导致门管区和周围的上皮肉芽肿形成，特别是在病变早期阶段。小叶胆管或间隔胆管的严重损伤可导致胆管缺失。PBC为什么只有小叶胆管和间隔胆管损伤目前还不十分清楚。在急性细胞（可逆）和慢性细胞排斥反应（不可逆）期间，肝的异体排斥反应可能发生在肝移植后，显示胆管炎症和小叶胆管损伤性缺失。而药物诱导的胆汁淤积性疾病主要累及胆管，移植物抗宿主病（GVHD）主要累及小叶间胆管。在其他疾病中，也可发现小的肝内胆管损伤，如成人特发性胆管缺失、免疫缺陷、机会性感染或病毒性胆管炎等。

总之，胆管细胞的异质性主要包括：①形态学，对胃肠激素和肽类的分泌应答，以及胆盐生理活性；②对毒素和肝损伤不同的增生和凋亡反应。

（陆伦根）

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