第3章　氨基酸

3.1　复习笔记

一、氨基酸

1蛋白质的水解

蛋白质能够被酸、碱或蛋白酶催化水解。根据蛋白质的水解程度不同，可分为完全水解和部分水解两种情况，水解产物得到的是各种氨基酸的混合物。如表3-1所示是蛋白质水解的几种方法。

表3-1　水解蛋白质的方法

2α-氨基酸的一般结构

（1）氨基酸是既含氨基又含羧基的有机化合物，常见的氨基酸有20种，除脯氨酸是亚氨基酸外，其余都是α-氨基酸。

（2）α-氨基酸是指羧酸分子中α-碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物，不同氨基酸之间结构的差异都由侧链基团R表现。

（3）氨基酸能以首尾相连的方式进行聚合反应，除去一分子水形成共价酰胺键，又称肽键。

（4）除甘氨酸外，其他的α-碳原子都是手性碳原子，因此都具有旋光性，且都为L型。

（5）除胱氨酸和酪氨酸外，一般都能溶于水；脯氨酸和羟脯氨酸还能溶于乙醇或乙醚中。

二、氨基酸的分类

为方便表达蛋白质或多肽的结构需要，氨基酸的名称常用三个字母的简写符号表示，有时候也用单字母的简写符号表示（表3-2）。

表3-2　氨基酸的简写符号

1常见的蛋白质氨基酸

常见的20种氨基酸根据侧链基团（—R）的化学结构可分为脂肪族、芳香族和杂环族（图3-1）；根据侧链基团的极性又可分为非极性氨基酸、不带电荷的极性氨基酸、带正电荷氨基酸和带负电荷氨基酸（图3-1）。

图3-1　氨基酸的分类

2不常见的蛋白质氨基酸

由相应的常见氨基酸经修饰（磷酸化、羟化、羧化、甲基化等）而来的，例如5-羟赖氨酸、4-羟脯氨酸、3-甲基组氨酸、γ-羧基谷氨酸等等。

3非蛋白质氨基酸

非蛋白质氨基酸不参与蛋白的组成，多是重要的代谢物前体或代谢中间物，它们不是蛋白质的结构单元，但在生物体内具有很多生物学功能。

（1）L-型α-氨基酸的衍生物：尿素循环中的L-瓜氨酸和L-鸟氨酸。

（2）D-型氨基酸：D-Glu，D-Ala（存在于肽聚糖中），D-Phe（存在于短杆菌肽S中）。

（3）β-氨基酸、γ-氨基酸、δ-氨基酸：β-Ala（泛素的前体）、γ-氨基丁酸（神经递质）。

三、氨基酸的酸碱化学

1氨基酸的兼性离子形式

氨基酸在晶体或水中主要是以兼性离子（偶极离子）的形式存在。氨基酸在水中的兼性离子既起着酸（质子供体）的作用，也起碱（质子受体）的作用，因此它为两性电解质。

2氨基酸的解离

（1）氨基酸解离步骤

氨基酸是一类两性电解质，其解离情况可用滴定测得，以甘氨酸为例，它是一个二元酸，它的分步解离步骤如下：

第一步解离（1）

第二步解离（2）

式中K_a1和K_a2分别表示甘氨酸羧基和氨基的解离常数。一般，共辄酸的解离常数按其酸性递降顺序编号为 K_a1，K_a2等。

（2）甘氨酸的滴定曲线（图3-2）

①滴定时，以加入的氢氧化钠的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线B段，在pH9.60处有一个拐点。从甘氨酸的解离公式（2）可知，当滴定至甘氨酸的兼性离子有一半变成阴离子，即[A0]＝[A－]时，则K_a2＝[H＋]，两边各取对数得pK_a2＝pH，这就是曲线B段拐点处的pH9.60。

②如果用标准盐酸滴定，以加入的盐酸的摩尔数对pH作图，则得滴定曲线A段，在pH2.34处有一个拐点。从解离公式（1）可知，pK_a1＝2.34，这里甘氨酸的等电兼性离子和阳离子的摩尔数相等，即[A0]＝[A＋]。根据

就可求得甘氨酸在溶液中的解离情况。

图3-2　甘氨酸的滴定曲线（解离曲线）

（3）注意事项

①20种基本氨基酸只有组氨酸在生理pH下有明显的缓冲容量，因为其他氨基酸的pK值都不在pH7附近；

②R基团不解离的氨基酸pK_a1范围2.0～3.0，pK_a2为9.0～10.0。

表3-3　20种氨基酸的解离常数和等电点

3氨基酸的等电点（PI）

氨基酸的带电状况与溶液的pH有关，氨基酸的等电点是指当溶液的pH使氨基酸带的正负电荷一样（净电荷为零）的时候，这时候氨基酸在电场中既不向正极也不向负极移动，即处于等电兼性离子状态时的溶液的pH。

（1）等电点的计算方法

①对侧链R基不解离的中性氨基酸而言，其等电点是它的pK_a1和pK_a2的算术平均值：

注意：pI值与该离子浓度基本无关，只决定于等电兼性离子两侧的pK_a值。

②对侧链R基是解离的酸性氨基酸而言，其等电点是它两个羧基pK_a的平均值。

③对侧链R基是解离的碱性氨基酸而言，其等电点是它两个氨基pK_a的平均值。

（2）氨基酸的带电状况与pH的关系

①在等电点以上的任一pH，氨基酸带净负电荷，在电场中将向正极移动。

②在低于等电点的任一pH，氨基酸带有净正电荷，在电场中将向负极移动。

③在一定pH范围内，氨基酸溶液的pH离等电点愈远，氨基酸所携带的净电荷愈大。

4氨基酸的甲醛滴定

氨基酸是两性电解质，不能直接用酸碱滴定来进行定量测定，是因为氨基酸的酸、碱滴定的等电点pH或过高或过低，没有适当的指示剂可被选用，所以选用甲醛来进行滴定。

（1）原理

向氨基酸溶液中加入过量的甲醛，用标准氢氧化钠滴定时，由于甲醛与氨基酸中的—NH₂作用形成羟甲基衍生物而降低了氨基的碱性，相对地增强了—NH₃的酸性解离，降低了氨基的碱性。

（2）滴定结果

甲醛滴定法的结果是当氨基酸溶液中存在1mol/L甲醛时，滴定终点由pH12左右移至pH9附近，刚好达到酚酞指示剂的变色区域。

四、氨基酸的化学反应

氨基酸的化学反应主要是指它的α-氨基和α-羧基以及侧链上的功能团所参与的反应，如表3-4所示。

表3-4　氨基酸的化学反应

五、氨基酸的光学活性和光谱性质

1氨基酸的旋光性

（1）氨基酸的构型

氨基酸由两种构型，即D型和L型。除甘氨酸外，其余的蛋白质氨基酸均有手性，且具有旋光性，为L型。

（2）旋光性

①外消旋物：是指旋光性物质在化学反应中，只要其不对称原子经过对称状态的中间阶段，便将发生消旋作用并转变为D型和L型的等摩尔混合物。

②内消旋物：是指分子内消旋的现象。

（3）蛋白质中L型氨基酸的比旋光度

氨基酸的旋光符号和大小取决于它的R基性质，并且与测定的溶液pH有关，因为在不同的pH条件下氨基和羧基的解离状态不同。

2氨基酸的光谱性质

参与蛋白质组成的20多种氨基酸在可见光区都没有光吸收，在红外区和远紫外区（λ＜200nm）都有光吸收，在近紫外区（200～400nm）只有芳香族氨基酸有吸收光的能力，因为它们的R基含有苯环共轭π键系统。

（1）酪氨酸的最大光吸收波长（λ_max）在275nm；

（2）苯丙氨酸λ_max＝257nm；

（3）色氨酸的λ_max＝280nm。

六、氨基酸混合物的分析分离

1分配层析法的一般原理

层析又称色层分析或色谱。层析系统通常由固定相或静相两个系统组成。混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数K_d来描述，即一种溶质在两种给定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值。待分离的物质由于彼此分配系数的不同，经过分配层析后最终分离开来。使用层析法分离氨基酸混合物时，先决条件是各种氨基酸成分的分配系数要有差异，分配系数越大越容易分开。

2分配柱层析

层析柱中的填充物（又称支持剂）都是一些具有亲水性的不溶物质，可以看作为固定相。沿固定相流过的与它不互溶的溶剂是流动相。当流动相移动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间将发生连续分配，混合物中具有不同分配系数的各种成分沿分配柱以不同的速度向下移动，收集出的氨基酸分别用茚三酮显色定量。以氨基酸量对洗出液体积作图，得洗脱曲线，曲线中的每个峰相当于某一种氨基酸。

3纸层析

纸层析的滤纸纤维素上吸附的水是固定相，展层用的溶剂是流动相。层析时，利用极性和非极性氨基酸在水（固定相）和有机溶剂（流动相）中溶解度的不同，所以各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的R_f值，它们分布在滤纸的不同位置上，在滤纸上进行分离。当用茚三酮溶液显色时可得到一个双向纸层析谱。

4薄层层析

薄层层析是把支持剂涂布在玻璃板上使成一个均匀的薄层，把要分析的样品滴加在薄层的一端，然后用合适的溶剂在密闭的容器中进行展层，使样品中各个成分分离开来，最后进行鉴定和定量测定。

5离子交换层析

离子交换层析利用离子交换剂上的活性基团和周围溶液中的离子进行交换时各种离子交换能力和洗脱时各种顺序的不同来达到分离的目的。交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂两大类。阳离子交换树脂含有的酸性基团可解离出H＋离子，当溶液中含有其他阳离子时，例如在酸性环境中的氨基酸阳离子可以和H＋发生交换而结合在树脂上，此时氨基酸与阳离子交换树脂之间的静电吸引力大小是碱性氨基酸（A2＋）＞中性氨基酸（A＋）＞酸性氨基酸（A0）因此各个氨基酸的洗脱顺序为酸性氨基酸，中性氨基酸，碱性氨基酸。

6气液层析

气液层析又称气液色谱或气相层析，是指当层析系统的流动相为气体，固定相为涂渍在固体颗粒表面的液体的层析技术。利用气相层析法进行分离是基于分配过程，即利用样品组分在流动的气相和固定在颗粒表面的液相中的分配系数不同达到分离组分的目的。

7高效液相层析

高效液相层析简称HPLC，是具有快速、灵敏、高效的优点的分离技术。HPLC的特点是：使用的固定相支持剂颗粒很细，因而比表面积很大；溶剂系统采取高压，因此洗脱速度增大。