第二节 微生物菌种的分离与筛选技术

一、概述

人类利用微生物已经有几千年的历史，而微生物通常是肉眼看不到的微小生命体，而且广泛存在于自然界。获得目的微生物的渠道主要包括向菌种保藏中心购买和自行分离两种。为了满足人们的需要以及食品行业中的多样性，性质优良的菌株不断被发现。在自然界中筛选较为理想的生产菌种是一件极其细致和艰辛的工作。当前，借助于先进的科学理论和自动化的实验设备，菌种筛选效率已大为提高。土壤是最丰富的微生物资源库，动、植物体上的正常微生物区系是重要的菌种来源，而各种极端环境更是开发特种功能微生物的潜在资源。

二、传统菌种分离与筛选技术

微生物菌种的分离与纯化是研究和利用微生物的第一步，是微生物研究工作中最重要的环节之一。微生物的分离纯化就是指从混杂的细胞群体中将不同的细胞区分开来达到分离纯化，主要是根据不同的细胞所具有的各种各样的特性来实现的，包括细胞的物理特性如密度、体积和电荷等，以及细胞的生物学特性如特异性表面标志和功能、对某种营养元素或抗生素的敏感性。不同种类的微生物，其特性和生理功能不同，因此，微生物的分离纯化方法也有差异。微生物分离筛选的基本指导依据主要有根据筛选目标对象微生物的分类、生理生化与代谢特性等基本信息，研究分离筛选的培养基成分、培养条件甚至结合对象微生物的生态学理论或生产产品的特性等，在此基础上设计分离筛选目标微生物。微生物分离筛选的基本步骤由以下几个环节表示，分别为设计方案、采样、增殖、分离和性能测定。

一般来说，菌种分离及筛选的操作流程如图3-1所示。

（一）采集菌样

首先选定目的微生物可能存在的场所，最常见的场所是土壤。由于每种微生物对生长环境包括营养物质、温度、水分、阳光、通风等的要求都有所不同，因此在选择场所时，必须对目的菌种有初步了解。比如要采集能分泌柚苷酶的菌株，查阅文献或相关资料发现柚苷酶是一种能够水解柚皮苷的胞外糖苷酶，而柚皮苷是柑橘类水果中富含的一种黄酮类物质，因此推测能分泌柚苷酶的菌株生长在柑橘类水果附近，从腐烂的柑橘类水果及其附近土壤就可以采集得到。

（二）富集培养

富集培养的首要任务是要找到适宜目的菌种的培养基，在自然条件下，凡有某种微生物大量生长繁殖的环境，必定存在着该微生物所必要的营养和其他条件，若直接采用这类自然基质经过灭菌，就可获得一个初级的天然培养基。例如上述的产柚苷酶的菌株为曲霉，查找相关资料得知曲霉的生长温度一般在28~30℃，常用的培养基为马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基。此外，可以根据菌种的特性适当增加或减少培养基成分或含量，比如，柚苷酶产生菌能分解柚皮苷产生葡萄糖，因此分离柚苷酶产生菌时在培养基中添加少量柚皮苷可以富集能产生柚苷酶的菌种。

（三）菌种分离纯化

传统分离纯化方法包括固体培养基分离法和液体培养基分离法，固体培养基分离法利用稀释平板对微生物进行分离纯化；液体培养基分离法利用接种物在液体培养基中进行顺序稀释来纯化菌种。这些方法无需特殊的仪器，分离纯化的效果好。

1．固体培养基法

（1）稀释倒平板法。先将待分离的材料用无菌水作一系列的稀释（如1∶10,1∶100, 1∶1000,1∶10000等），然后分别取不同稀释液少许，与已溶化并冷却至45℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落（图3-2）。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。

（2）涂布平板法。将一定浓度、一定量的待分离菌液移到已凝固的培养基平板上，再用涂布棒快速地将其均匀涂布，使之长出单菌落而达到分离的目的。简要操作步骤：①将涂布器浸在盛有酒精的烧杯中。②取少量菌液（不超过0.1mL）滴加到培养基表面。③将沾有少量酒精的涂布器在火焰上引燃，待酒精燃尽后，冷却8~10s。④用涂布器将菌液均匀地涂布在培养基表面，涂布时可转动培养皿，使菌液分布均匀（图3-3）。

（3）平板划线分离法。最简单的分离微生物的方法是平板划线法（图3-4），即用接种环以无菌操作沾取少许待分离的材料，在无菌平板表面进行连续划线，微生物细胞数量将随着划线次数增加而减少，并逐步分散开来，如果划线适宜的话，微生物能一一分散，经培养后，可在平板表面得到单菌落。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。划线的方法很多，常见的比较容易出现单个菌落的划线方法有斜线法、曲线法、方格法、放射法和四格法等。

2．液体培养基法

接种物在液体培养基中进行顺序稀释，至高度稀释度，一支试管分配不到一个微生物；必须在同一个稀释度的许多平行试管中，大多数（95%以上）表现为不生长；有微生物生长的试管得到的培养物就认为是纯培养。

除了以上方法外，还可利用选择培养基进行直接分离富集培养，或者单细胞（单孢子）培养法，但是有些微生物菌种很难进行人工培养，在实验室条件下较难培养出菌落。这种情况还需结合微生物生态学理论综合处理或通过分子生态检测技术加以进一步研究，再制订相应的分离纯化方法。

3．单细胞分离法

只能分离出混杂微生物群体中占数量优势的种类是稀释法的一个重要缺点。在自然界，很多微生物在混杂群体中都是少数。这时，可以采取显微分离法从混杂群体中直接分离单个细胞或单个个体进行培养以获得纯培养，称为单细胞（或单孢子）分离法。单细胞分离法的难度与细胞或个体的大小成反比，较大的微生物如藻类、原生动物较容易，个体很小的细菌则较难。对于个体较大的微生物，可采用毛细管提取单个个体，并在大量的灭菌培养基中转移清洗几次，除去较小微生物的污染。这项操作可在低倍显微镜，如解剖显微镜下进行。对于个体相对较小的微生物，需采用显微操作仪，在显微镜下用毛细管或显微针、钩、环等挑取单个微生物细胞或孢子以获得纯培养。在没有显微操作仪时，也可采用一些变通的方法在显微镜下进行单细胞分离，例如将经适当稀释后的样品制备成小液滴在显微镜下观察，选取只含一个细胞的液体来进行纯培养物的分离。单细胞分离法对操作技术有比较高的要求，多限于在高度专业化的科学研究中采用。

4．选择培养基分离法

没有一种培养基或一种培养条件能够满足一切微生物生长的需要，在一定程度上所有的培养基都是有选择性的。如果某种微生物的生长需要是已知的，也可以设计特定环境使之适合这种微生物的生长，因而能够从混杂的微生物群体中把这种微生物选择培养出来，尽管在混杂的微生物群体中这种微生物可能只占少数。这种通过选择培养进行微生物纯培养分离的技术称为选择培养分离，特别适用于从自然界中分离、寻找有用的微生物。自然界中，大多数场合中的微生物群落是由多种微生物组成的，从中分离出所需的特定微生物是十分困难的，尤其当某一种微生物所存在的数量与其他微生物相比非常少时，单采用一般的平板稀释法几乎是不可能的。要分离这种微生物，必须根据该微生物的特点，包括营养、生理特征、生长条件等，采用选择培养分离的方法。或抑制其他大多数微生物不能生长，或造成有利于该菌生长的环境，经过一定时间培养后使该菌在群落中的数量上升，再通过平板稀释等方法对它进行纯培养分离。

5．二元培养物

分离的目的通常是要得到纯培养，然而，在有些情况下这是很难做到的。但可用二元培养物作为纯化培养的替代物。含有两种以上微生物的培养物称为混合培养物，而如果培养物中只含有两种微生物，而且是有意识的保持二者之间的特定关系的培养物称为二元培养物。例如二元培养物是保存病毒的最有效途径，因为病毒是细胞生物的严格的细胞内寄生物；有一些具有细胞的微生物也是严格的其他生物的细胞内寄生物，或特殊的共生关系。对于这些生物，二元培养物是在实验室控制条件下可能达到的最接近于纯培养的培养方法。另外，猎食细小微生物的原生动物也很容易用二元培养法在实验室培养，培养物由原生动物和它猎食的微生物二者组成，例如，纤毛虫、变形虫和黏菌。

在以上介绍的几种方法中，平板分离法普遍用于实验室微生物的分离与纯化。微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落，通常是由一个细胞繁殖而成的集合体。因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获取单个菌落的方法可通过稀释涂布平板或平板划线等技术完成。值得指出的是，从微生物群体中经分离生长在平板上的单个菌落并不一定能保证是纯培养。因此，纯培养的确定除观察其菌落特征外，还要结合显微镜检测个体形态特征后才能确定，有些微生物的纯培养要经过一系列分离与纯化过程和多种特征鉴定才能得到。

（四）菌种的鉴定

在获得纯培养物后，需要对菌种进行鉴定，可通过表型特征以及遗传特征进行鉴定，真菌类微生物一般可以通过表型特征进行鉴定，主要包括观察菌落形态、生理和代谢特征以及生态特征。分子方面的鉴定可通过提取总DNA，扩增ITS区域(16SrDNA或28SrRNA), NCBI数据库进行比对，选择近缘序列构建系统发育树进行鉴定。

（五）知识产权保护的申请

知识产权的问题越来越得到人们的关注，尤其是针对竞争激烈的微生物资源，研究方案都是应该被严格保护的，同时微生物资源开发包含重大的经济利益，也包含重大的风险，为了保护自己的知识产权，在做好保密工作的同时，及时申请专利是非常必要的。

（六）菌种的改良

微生物资源的开发与利用在某种意义上讲是微生物天然功能在人工控制条件下，按照人的意志进行改造。菌种改良的方法主要有传统的随机诱变法和基因工程手段。传统的随机诱变法使菌种发生基因突变，尽管这种方法与基因工程技术相比存在盲目性大、工作量大等不足，但容易实施，因此仍然是目前菌株改造最有效的方法。

（七）微生物生长条件优化、放大实验及工程化

微生物都有其最适的生长条件，如温度、酸度、水分活度等，在菌株未应用之前，应对该菌进行条件优化，一般的优化指标有pH、温度和水分活度等。放大实验或中试是微生物资源开发研究中一个重要的环节，其主要目的是对前期实验的验证和进一步探索。

三、食用菌的分离与鉴定方法

人们有目的地将特定品种食用菌的菌丝体单独分离出来，从而将获得的菌丝体进一步纯化的过程为食用菌菌种分离。通常用的方法有组织分离、孢子分离、基内菌丝分离法及培养料分离法。通过观察食用菌的生长情况即可对其进行鉴定。

（一）组织分离法

即通过切取菌索、子实体、菌核的新鲜幼嫩的组织进行分离，以获取纯菌丝的方法，属于无性繁殖，最常用的菌种分离法之一。

（二）孢子分离法

即将食用菌成熟的有性孢子（担孢子或子囊孢子）在适宜的培养基上萌发成菌丝体而获得的纯培养的方法，程序如下：选择种菇—种菇消毒—采收孢子—接种—培养—挑菌落—钝化菌种—母种。运用此法可获得强活性、短菌龄的菌丝，同时可分离得到兼有双亲遗传特性的有性孢子，可用于杂交育种和选育新种，适用于产孢子的真菌。

（三）基内菌丝分离法

即从食用菌生长基质中分离选择获得纯菌种的方法。如可利用菇木及土壤等作为分离材料进行分离。此法操作较复杂，但适宜不易采得子实体、错过子实体发生时期的菌类或胶质菌的菌种分离。

（四）培养料分离法

选择长有优质子实体的移栽袋，待子实体长到成熟度80%时去子实体，对栽培袋进行消毒，同时将接种工具和接种培养料一起放入接种袋，消毒、接种，并在适宜条件下培养。

四、微生物分离检测的发展

在分离筛选微生物时通常我们使用选择性培养基来获得单个的纯化目的微生物，对于受到损伤的和热应激的微生物还需要经过增菌培养，增菌过程包括前增菌、选择性增菌和后增菌，因此从样品中分离检测某些微生物特别是病原微生物时需要很长时间，实际上检测时间主要是等待增菌时间，这样就远远不能适应快速检测的需要，为了缩短检测时间，有些学者考虑利用非选择性增菌的方法来替代常规选择性增菌步骤，节省了大量的时间，然后再用常规的标准方法来检测和鉴定分离目标微生物。以下介绍几种快速检测分离微生物的方法。

（一）利用PCR-DGGE（基于聚合酶链式反应的变性梯度凝胶电泳）技术指导功能微生物的分离

由于食品成分的复杂性和微生物代谢途径的多样性，食品中微生物鉴定是一件重要但复杂的工作。现在通过分子生物学的方法在分子水平上分析食品中微生物群落结构和检测微生物群落动态变化。

原理：采用PCR-DGGE技术对微生物群落进行多样性分析，并将得到的信息用于指导微生物的分离，利用PCR将微生物扩增电泳进行图谱分析，切割胶回收DNA进行测序，将测序结果进行比对。

方法：基因组总DNA的提取；基因组总DNA16S rDNA高可变区的PCR扩增；16S rDNA序列高可变区的DGGE分析；DNA片段序列分析。

应用：Orphan等通过扩增水样中微生物群落总DNA的16SrDNA片段并克隆建库分析了高温油田微生物群落结构的组成；佘跃惠等基于16 SrDNA V3高可变区的PCR-DGGE图谱分析结合条带割胶回收DNA进行序列分析，对新疆油田注水井和相应采油井微生物群落的多样性进行了比较并鉴定了部分群落成员（佘跃惠，2005）。程海鹰等采用PCRDGGE分析了在高温、高压和厌氧条件下富集培养的油藏内源微生物（程海鹰，2008）。这些研究探讨了油藏微生物的种群多样性，为内源微生物采油提供了清晰的生态学背景，从而为内源微生物提高石油采收率的机理研究提供更多理论依据。但是目前还没有利用该技术对油藏微生物进行指导分离。

（二）针对性筛选方法——产果胶酶微生物筛选

1．透明带法

透明带法是将试验用果胶酶加入果胶培养基上，恒温培养数小时后试管培养基上部有略透明部分，用游标卡尺量出透明带高度，透明带越高证明酶活越大。这种方法不需加入特殊药品，它所形成的透明带较明显，具有简便、快速、结果直观可信的特点，一次试验可以同时做很多组样品，省时省力，工作效率高，适用于果胶酶微生物的筛选和酶活性的定性鉴别。

2．透明圈法

（1）高碘酸透明圈法。利用果胶降解物在高碘酸中的溶解差别可以定性判断果胶酶的存在。由于大分子聚合物不溶于酸，果胶酶降解的小分子溶于酸从而在琼脂培养基板上形成透明圈。用果胶酶底物、缓冲液、淀粉和琼脂配成溶液铺板，然后加入少量的酶液，注入一点，反应一段时间后，加入高碘酸，如果该酶有活性，注入酶的点将出现透明圈。进一步可以倾出高碘酸溶液，加入砷酸钠溶液，根据淀粉与碘的颜色反应，更易清楚地判明透明圈的存在。该方法对于果胶酶产生菌的筛选较方便，而且可以变换底物及pH等区别不同种类的果胶酶。

（2）刚果红染料透明圈法。刚果红染料可与果胶分解物即多糖水解物形成有浓郁色泽的复合物。测定时可用牛津杯法，将酶液加入培养基上的牛津杯中，由于所配制的果胶平板培养基中果胶是唯一碳源，所以能在其中生长的菌落均有能力产生果胶酶，作用数小时后，再加入刚果红染色，用蒸馏水荡去薄层表面刚果红，对光即可见明显的绛红色透明圈出现。进一步可以使用盐酸进行固定，透明圈立即变成蓝色，此时透明圈仍清晰可见，但抑制了酶活力；酶活力可根据透明圈的大小判断。

（3）十六烷基三甲基溴化胺透明圈法。十六烷基三甲基溴化胺（多糖沉淀剂）与果胶分解物也可形成无色透明圈，但背景带乳白色，在果胶用量较大时结果较清晰，这种方法果胶用量较大，在实际运用中受到限制。

3．电泳转移胶膜法

电泳转移胶膜法的依据是果胶酶底物聚半乳糖醛酸盐能被特殊染色剂染色。预先制备好聚半乳糖醛酸盐——琼脂糖超薄膜，果胶酶成分会自电泳凝胶上扩散进入超薄膜，经保温后，置于溴化十二烷基三甲基胺溶液（或钌红溶液）中保温，此时未被酶降解的薄膜区域将染上颜色，酶作用的位点留下透明圈。用此法来检测微量的果胶水解酶和裂解酶有一定优点，适于对电泳分离后的果胶酶作活性评价，也可用来筛选产果胶酶菌株，但操作过程较为烦琐。

（三）针对性筛选方法——产柚苷酶微生物筛选

以柚苷酶产生菌株JMUdb054的筛选过程为例（集美大学食品与生物工程学院研究案例），了解食品新型菌株的筛选过程（图3-5）。

1．原理

柚苷酶是由α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase)和β-D-葡萄糖苷酶(β-D-glucosidase)组成的复合酶，它在柑橘类果汁脱苦、鼠李糖生产、食品增香、制药工业等方面具有重要的应用价值(Yadav, et al.,2010)。柚苷酶可将柑橘类水果中的苦味物质——柚皮苷水解成无苦味的柚皮素，其中α-L-鼠李糖苷酶将柚皮苷分解为普鲁宁和鼠李糖，β-D-葡萄糖苷酶又把普鲁宁分解成无苦味的柚皮素和葡萄糖。如果以柚皮苷为唯一碳源或主要碳源配制培养基，柚苷酶产生菌因为产生柚苷酶，可以分解柚皮苷获得葡萄糖和鼠李糖而快速生长，因此，可以用以柚皮苷为碳源的培养基进行平板分离和初筛，再通过测定菌株发酵液的柚苷酶活力进行复筛而分离得到柚苷酶产生菌株。

2．实验材料与培养基

腐烂的柑橘果实及腐烂柑橘果实堆积处的土壤样品。

基础培养基（包括牛肉膏蛋白胨培养基、高氏培养基、查氏培养基、马铃薯培养基、斜面保存培养基），以柚皮苷为唯一碳源的固体平板发酵培养基和选择性液体培养基。

3．筛选流程

4．柚苷酶活力的测定

用高效液相色谱法测定酶活力。将液体发酵液于常温下5000r/min离心10min后取上清液作为粗酶液。准确量取1.0mL柚皮苷标准溶液(250μg/mL)与950μL柠檬酸—磷酸氢二钠缓冲液(pH5.0)混合，置于50℃恒温箱保温5min，迅速加入50μL初酶液，于50℃恒温箱中反应5min后立即于100℃沸水浴中加热20min，迅速冷却，经15000r/min离心10min后用0.45μm滤膜过滤，利用HPLC法测定柚皮苷和柚皮素的含量（色谱图如图3-6所示）。空白对照加入的酶液需事先灭活处理，按上述方法操作。

5．实验结果

分离得到真菌146株、细菌218株以及少量放线菌。平板初筛选得到128株菌株对柚皮苷有分解作用（数据从略），说明这些菌株可能会产生降解柚皮苷的酶，即柚苷酶。经复筛得到一株具较强活力的柚苷酶菌株4-D6（图3-7）。

6．菌株的初步鉴定

通过对菌株4-D6有性生殖、菌落形态、染色、制片及显微观察，发现该菌株含有有性世代；菌落在PDA上生长状况良好，菌落呈椭圆形，表面突起为毛绒状，边缘粗糙，菌落初期菌丝为白色，生长孢子后为黑色，据此判断其繁殖器官为分生孢子或粉孢子；菌丝体呈绒毛状，分生孢子无隔膜，呈球形或拟卵圆形等；孢子梗无分枝，分生孢子聚成头状且串生；分生孢子梗从壁厚而膨大的菌丝细胞（足细胞）垂直生出，顶端膨大成球形的泡囊，分生孢子穗球形，紫褐色至黑色（图3-8）。与真菌鉴定手册第496页中的检索表中的描述[分生孢子穗球形，紫褐色至黑色（少有褐色或浅色的）]相符。与丛梗孢科(Moniliaceae)、单孢亚科(Amerosporoideae of Moniliaceae)、曲霉族(Aspergilleae)、曲霉属(Aspergillus Mich.ex Fr.)、黑色曲霉组的描述基本上相吻合。进一步通过ITS-5.8SrDNA序列和钙调蛋白基因序列系统进化分析表明该菌株是塔宾曲霉（图3-9）。

五、微生物菌种的保藏

微生物菌种是一种极其重要而珍贵的生物资源，菌种保藏是一项十分重要的基础性工作。菌种保藏机构的任务是在广泛收集实验室和生产用菌种、菌株、病毒毒株（有时还包括动、植物的细胞株和微生物质粒等）的基础上，将它们妥善保藏，使之不死亡、不衰退、不污染和不降低生产性能，以供科研和生产单位之用。为此，国际上一些较发达国家都设有国家级的菌种保藏机构。例如，中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型菌种保藏中心(ATCC)、英国的国家典型菌种保藏所(NCTC)以及日本的大阪发酵研究所(IFO)等都是有关国家的代表性菌种保藏机构。

（一）菌种保藏原理

用于长期保藏的原始菌种称保藏菌种或原种。菌种保藏的基本原理是：首先应挑选典型菌种或典型培养物的优良纯种，最好采用它们的休眠体（如芽孢、分生孢子等）；其次是根据微生物的生理生化特性，人工创造一个有利于休眠的良好环境条件，如低温、干燥、缺氧、缺乏营养素，以及添加保护剂或酸度中和剂等，使微生物处于代谢活动不活泼、生长繁殖受到抑制的休眠状态。

干燥和低温是菌种保藏中的最重要因素。据试验，微生物生长温度的低限约在－30℃，而酶促反应低限在－140℃。低温须与干燥结合，才有良好保藏效果。细胞体积大小和细胞壁的有无影响着细菌对低温的敏感性，一般体积大和无壁者较敏感。冷冻保藏前后的降温与升温速度对不同生物影响不同。细胞内的水分在低温下会形成破坏细胞结构的冰晶体，而速冻可减少冰晶体的产生。在实践中发现，较低温度更有利于保藏，如液氮(－196℃)和－80℃的预冻效果显著好于－25℃。冷冻干燥时添加适当保护剂可以提高菌种存活率，常用保护剂有：渗透保护剂（如甘油等）、半渗透保护剂（如海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖、果糖、葡萄糖、山梨醇、甘露醇、肌醇等）、非渗透保护剂（脱脂乳、血清白蛋白、酪蛋白、酵母粉、β-环糊精、麦芽糊精、葡聚糖、透明质酸钠、可溶性淀粉、纤维素等）、抗氧化保护剂（维生素C、谷氨酸钠等），其中保护效果较好的有甘油、海藻糖、蔗糖、脱脂乳、透明质酸钠、维生素C、谷氨酸钠等，其保护机理：①甘油的羟基与胞内蛋白质形成氢键，以取代由水分子形成的氢键，从而保持蛋白质原有结构的稳定性。甘油还可与菌体表面自由基联结，避免菌体暴露于介质中。②糖类和醇类的羟基与蛋白质中的极性基团或与细胞膜磷脂中的里氨酸基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性。除此之外，海藻糖还具有较大的水化面积，能竞争结合更多的蛋白质水化层中的水，减少冰晶体的生成，并使蛋白质结构更加紧密。③脱脂乳等高分子保护剂以包裹形式在菌体表面形成保护层，如乳清蛋白形成的蛋白膜，可减少因细胞壁损伤而引起的胞内物质泄漏，避免菌体暴露于氧气和介质中。此外，乳中其他成分亦有保护作用。④抗氧化保护剂可减轻过氧化物自由基对细胞的损伤作用，保护细胞结构和功能不被破坏。不同保护剂对不同菌种的保护效果各异，而且各类保护剂的保护机理各有千秋，一般复配的保护效果要优于单一保护剂，故实践中通常以脱脂乳为基础保护剂，通过试验获得复配的保护剂的最优组合配方。使用复配保护剂时，通常按一定比例与离心收集的菌泥混合，先于－80℃预速冻，再以冻干机进行干燥，即为冻干菌粉；或直接于－80℃条件下快速冷冻，即为冷冻菌液。

（二）常用的菌种保藏方法

一种良好的菌种保藏方法，首先应保持原菌优良性状长期稳定，同时还应考虑方法的通用性、操作的简便性和设备的普及性。在国际上最有代表性的美国ATCC中，近年来仅选择最有效的冷冻干燥保藏法和液氮保藏法保藏所有菌种，两者结合既可最大限度减少不必要的传代次数，又不影响随时分发给全球用户，效果甚佳。我国CCCCM的菌种保藏规模目前为亚洲第一（有1.4万余株各种微生物），现采用斜面传代法、冷冻干燥保藏法和液氮保藏法进行保藏。具体操作方法详见基础微生物学实验教程。