1.3 植物组织培养的理论依据及有关现象

1.3.1 细胞全能性学说

组织培养技术得以建立的最重要的依据是植物细胞全能性（totipotency）理论。植物细胞全能性的概念是指植物机体的每个生活细胞具有相同的遗传组成，在适当条件下都能够形成具有繁殖健全下一代的完整植株的能力[39]。细胞全能性的最高表现是受精卵（或称合子），在组织培养物中形成芽（它能产生完整植株）也是植物细胞全能性的典型表现。细胞、组织或器官离体培养以后不同程度地脱离了多细胞机体中细胞的相互制约，表现出不同程度的全能性。

1.3.2 分化和脱分化

所谓分化（differentiation）指个体发生中由受精卵产生的、具有相同遗传组成的细胞在形态、结构、化学组成和生理功能诸方面产生差异，形成不同类型特化细胞的过程[40]。从分子生物学观点看，细胞分化的本质变化是发生差别基因表达、合成专一性蛋白质，细胞产生稳定的遗传表型[41]。分化是相对的，多细胞植物体内各细胞分化程度不同。根据细胞特化程度和它们的分裂能力可以将植物体的细胞分为三类：第一类如茎尖、根尖和形成层细胞，它们始终保持旺盛的分生能力，从一个细胞周期进入另一个周期；第二类是高度特化的细胞，如筛管、导管和气孔器的保卫细胞，永远失去分生能力；第三类如表皮细胞和各种薄壁组织细胞，在通常情况下不进行DNA合成和细胞分裂，但在受到适当的刺激后可以重新开始DNA合成和细胞分裂，称为G0期细胞[42]。

脱分化（dedifferentiation）即分化的逆转，细胞失去已有的分化特征，恢复到相对不分化的分生组织状态。脱分化也应当是在基因的选择性表达的基础上进行的一系列生理、生化变化，使分化细胞变成胚性细胞的过程。植物学上关于脱分化的概念有不同的理解。从形态学、组织学和生理学上看，已经分化的细胞通过一系列的细胞分裂和细胞内部的改组逐渐失去各种分化的特征，因而认为脱分化是渐进的、分阶段的和较长的过程。另一种观点则从细胞周期角度来考察脱分化问题：已经分化的、脱离了细胞周期的G0期的细胞在某种刺激下重新回到细胞周期的G1期，开始了新的DNA合成时，即完成了脱分化；脱分化完成以后才进行细胞分裂，细胞分裂是脱分化的结果[42][43]，因此他们认为脱分化过程是相当迅速的。

再分化（redifferentiation）即经过脱分化的细胞、组织重新获得不同分化程度的特征。组织培养工作者一般都认为愈伤组织是脱分化的产物。一般对脱分化理解得过于笼统。但是在组织培养实践中可以看到，有的愈伤组织具有产生该种植物各种类型细胞、组织和器官甚至植物体的全部潜能，这是比较彻底的脱分化，差不多恢复到受精卵的状态。但是也常常看到有些在不同种类和不同浓度外源激素调控下既能分化出生殖器官，又能再生营养芽的情况[44]，说明这类愈伤组织或外植体细胞只是部分地脱分化，只部分地恢复了细胞的全能性，并在此基础上进行相应的细胞、组织和器官的再分化。从这里可以看出，再分化的产物可以反衬出脱分化也是相对的、分阶段的，而非一次完成的。

李正理、崔克明等通过树木剥皮后形成层活动和新皮再生的长期研究，对分化、脱分化和再分化关系有了更深一层的认识。崔克明[45]结合自己的研究和组织培养的新成就（如陆文樑等的工作）提出植物细胞分化阶段性的假说，其内容可概括为：细胞分化过程分为许多相继有序、不可逾越的阶段；分化过程中有一个临界期，分化到达临界期之前是可逆的，可以脱分化或转分化（为其他结构），过了临界期就成为不可逆（即不能脱分化）了；脱分化也有阶段性，可以完全脱分化，也可以不完全脱分化而停止于某一阶段；细胞分化的最后阶段是细胞编程死亡。

1.3.3 细胞决定与细胞分化

决定（determination）一词来自动物胚胎学，指胚胎某一区域的细胞获得向某一特定方向分化而排除其他可能性的预定发育状态。

先看一看植物细胞的稳定变化和记忆效应：一种蕨类的紫萁属植物Osmunda cinnamonea的孢子体，其幼小的叶原基离体培养能产生完整的茎轴系统（shoot）；随着叶原基年龄的增长，茎轴系统的发生率减少，叶子的发生率增加。这说明早期的叶原基具有与茎分生组织相同的发育潜能，后来叶原基发生了稳定的变化，它的发育潜能局限于形成叶[46]。另一种南洋杉属植物Araucaria excelsa具有直立的主干和塔状的树形，其上长出分层排列的一级分支，一级分支上生出水平伸展的二级分支。Vöchting[47]在扦插试验中发现，主干的茎尖生长成正常的完整植株；一级分支顶端的插条能够分支，但不能直立生长；二级分支顶端的插条不能分支，而长成线状伸展的枝条。来源于花器官的外植体在适当的培养条件下易于分化花芽[44]。这些实验展示了植物的记忆效应，证实了这些枝条的分生组织的发育潜能受到了限制，而且这种决定的状态在分裂产生的细胞群体中持续下去[48]。

按照细胞分化的决定学说，植物细胞的分化分为两个阶段：第一阶段为细胞分化的（预）决定阶段，包括自细胞进入感受态（competence）开始的诱导（induction）过程和达到确定细胞命运的决定状态。在这一阶段，决定了发育命运的细胞并不带有任何明显的标志而被直接观察到，只有进行实验操作（例如离体培养）[49]时或者借助特殊的细胞标记方法[50]才能觉察。所谓感受态，即细胞的反应状态，具有对特定刺激产生反应的能力的状态。植物细胞进入感受态，才能感受特定的刺激。在离体培养中，外植体的细胞经过脱分化，进入感受态，再经过诱导，进入决定状态，确定细胞分化的命运[48][49]。细胞进入感受态和达到决定状态所需的时间（即脱分化过程）随细胞的基因型和细胞来源的不同而有差异，它是可以通过实验设计定量测定的[49]。第二阶段是表达阶段，决定了命运的细胞发生一系列变化，形态发生的潜能得以表达。

已如前述细胞的决定状态是稳定的，但在一定条件下并不是不可逆的。在适当的刺激下，受限制的发育潜能可以改变[48]。例如，一种仙人掌属植物Opuntia polycantha的茎端分生组织培养于含细胞分裂素的培养基中形成叶，培养于含赤霉素的培养基中则形成刺。洋常春藤（Hedera helix）的幼株和成年株有不同的形态和生长习性。在嫁接实验中，无论用幼株或成年株作接穗或砧木，接穗长出的枝条总是与接穗相同。但成年接穗用赤霉素处理后转变成稳定的幼年状态。因此，发育状态的转变虽然非常稳定，但并非恒久不变的。决定状态的稳定性既取决于培养物本身的特性，也与培养条件密切相关。植物培养物易受外界条件的影响，常常失去原有的决定状态或分化特征而表现出高度的可塑性[50]。这可能是植物学工作者常常忽视“决定”现象的客观原因。

1.3.4 植物器官克隆及相应的假说和设想

在1.2.3小节中已经提及陆文樑实验室的成就。他们通过严格掌握分离外植体的器官在供体植株中分化的时期，准确控制外源激素的浓度，在一定时间之内控制外植体不断再生被子植物的各种器官，即所说的“器官克隆”[51][52]，并从中得到了许多规律性的认识，提出了一些试图阐明“器官克隆”的假说，现分别介绍如下：

1．细胞全能性的完全表达和部分表达假说

通过离体培养在外植体上不断再生某种器官、器官内分化特定的组织或细胞。这种情况与外植体上再生植株既有共同点又不完全相同。共同点是二者均为特定外因的诱导下细胞潜能的表达；不同点在于再生完整植株是细胞全能性的完全表达，再生器官及器官中特定组织或特定细胞则属于“细胞全能性的部分表达”。

2．细胞的发育和逆发育的设想

①受精卵具有最大的发育潜能，由受精卵发育成导致器官发生的主胚性细胞团和导致器官中特定组织和特定细胞分化的次级胚性细胞团。决定器官发生的各类器官特征基因只在主胚性细胞中按次序激活，决定各种组织和细胞发生的基因只在次级胚性细胞中按次序激活。

②主胚性细胞具有发育和逆发育的特性（图1-1）。主胚性细胞中基因按程序表达的过程是发育，从正在表达的时期退回到以前已经表达过的时期是逆发育，在某个发育或逆发育年龄段必定分化与这个年龄段相应的器官。

③在植物个体发育中，当卵受精转变成主胚性细胞后表现出发育的特性，在发育的不同时期必定分化出相应的器官。

④在离体培养中不同浓度外源激素的作用下，外植体细胞脱分化形成的主胚性细胞表现出不同程度的逆发育的特性，分别退回到它们以前的各个年龄段，并在这些年龄段分别进行器官再生，分化出这个年龄段应该分化的器官。

⑤细胞逆发育必定与细胞脱分化同时发生。

3．生长素浓度对离体器官按次序发生的影响及其转换开关的作用假说

（1）从风信子花被片到果实状结构的再生

风信子花芽外植体培养在附加2mg/L 6-BA和0.1mg/L 2,4-D的培养基上诱导直接形成花芽原基后，若在这种培养基上连续继代培养，则再生花芽中不断地分化花被片，但不会分化雄蕊和雌蕊；若转移到生长素浓度较低的培养基上，再生花芽的生长点上就不再形成新的花被片，转而形成雄蕊；若在这样的培养基上连续继代培养，则雄蕊的数量不断增加而不会分化雌蕊；若在雄蕊分化后进一步降低生长素浓度，则有利于胚珠的发生。根据实验，这种规律性一直延伸到大孢子母细胞形成。胚珠原基分化后若不进一步降低培养基中生长素浓度，则大孢子母细胞不能分化。于是陆文樑等便形成了花芽主胚性细胞团中生长素浓度的梯度降低在各轮花器官依次发生中起“转换开关”的作用的设想。有关该设想的主要论点简述如下（若要更详尽地了解，可参考陆文樑的文章[51][52]）：

①花芽主胚性细胞团通过生长素浓度来控制各轮花器官的数目。

②不同花器官的分化需要不同浓度的生长素。

③花器官的分化从外轮到内轮所需要的生长素浓度逐渐降低。

④在这种生长素浓度梯度变化中各级浓度的变化起器官分化的“转换开关”的作用。在器官按次序发生中，起着抑制上一个器官的特征基因表达，同时又激活下一个器官的特征基因表达的作用。

⑤花芽中四轮花器官分化的次序不因外源激素的变化而改变。

（2）从营养芽到花芽再生

以花叶千年木为材料诱导愈伤组织分别再生幼龄态营养芽、成年态营养芽、花序、花序分支、花芽和花被片，所需的生长素浓度逐渐升高，见图1-2。

（3）综合以上（1）和（2）可以看出，以花芽分化为转折点，对于植株分化花芽以前的器官来说，越是早期的器官，再生需要的生长素浓度越低；对于植株分化花芽原基以后形成的器官来说，越是晚期的器官，再生需要的生长素浓度越低，见图1-3。由于离体培养的外植体脱离了供体植株，它的发育与再生是自律的，不受整体植株的调控。观察外源激素的浓度变化对器官分化的影响，就能够比较容易地了解激素对器官分化的控制。

1.3.5 组织培养中发生的变异

按照细胞全能性学说，每个生活的植物细胞都具有相同的遗传信息，由它们得到的再生植株应当显示完全相同的遗传特性。但是通过离体培养，由愈伤组织得到的再生植株在形态和生化特征、特化的功能、成熟期和器官发生的潜能等方面常常出现变异。有两类不同传递特点的变异：表观遗传变化和体细胞无性系变异。

1．表观遗传变化

表观遗传变化（epigenetic change）又称为后生变化。组织培养中常常看到有些表现型可以在愈伤组织的继代和克隆繁殖中传递，但是经过有性生殖后往往就消失了。现举一类关于“驯化（habituation）”现象的例子。1942年，Gautheret在菊芋（Helianthus tuberosus）块茎切片离体培养中发现，随着继代培养的进行，细胞发生了性质上的变化。初次培养时，菊芋组织在含10-5mol/L IAA的培养基中达到最大的生长量，继代培养一次达到最大的生长量对IAA浓度要求降低为10-6mol/L，继代二次又降至10-7mol/L。他又以胡萝卜薄壁组织为材料，初次培养时，IAA浓度达到10-6mol/L才能得到最大的生长量，继代多次以后在不含IAA的培养基上也能达到同样的生长量。在葡萄的形成层组织的离体培养中也出现同样的现象。这种随着继代培养的进行对培养基中所含物质含量要求的降低，直至变成生长素自生的特性变化可以随着细胞系的繁殖传递下去的现象，称为驯化。

驯化现象也表现在愈伤组织对细胞分裂素的需求[39]上。烟草叶组织离体培养中只有提供外源细胞分裂素才能连续地生长；同一烟草植株的茎皮层组织在相同的培养条件下却具有细胞分裂素自生能力。这两种组织的细胞克隆后仍保持各自的表现型，说明这两种状态可通过细胞遗传。然而由叶细胞和茎皮层细胞克隆得到的再生植株的叶和茎皮层组织显示出与由种子产生的植株的同类组织相同的表现型。因此，Nanney提出存在两个遗传系统的假说[53]：一个遗传系统与机体有性世代之间发育潜能的传递有关；另一个表观遗传系统或后生（即发育的）系统，与基因表达方式（而不是基因组的永久性变化）的体细胞传递有关。有关驯化的机理至今还不是很清楚。

2．体细胞无性系变异

按照细胞全能性理论，同一植株的各个细胞再生出来的植株应当具有相同的遗传特性。不过与有性生殖的后代相比，同一无性系各植株之间总体上的确比较整齐一致。但是，通过愈伤组织再生的植株也常常出现各种变异。Sacristan和Melchers于1969年首先报道了由长期培养的烟草愈伤组织再生的植株出现的各种形态学变异。后来Heinz和Mee分别于1969和1971年在甘蔗的再生植株中观察到高频率的变异。Larkin和Scowcroft在评述中将这种现象称为体细胞无性系变异（somaclonal variation）[54]。

早期的研究着重在马铃薯、甘蔗、菠萝等遗传背景非常复杂的营养繁殖植物上，那时认为无性系变异可能是供体植株中预先存在的变异或供体植株是细胞嵌合体造成的。以后在许多自交植物的体细胞再生植株和花粉植株上也观察到高频率的体细胞无性系变异。朱至清在评述性文章[55]中指出：体细胞无性系变异是长期继代培养中出现的普遍现象；变异频率一般在百分之几到百分之几十之间，远高于自发突变频率；变异频率的高低与外植体来源及培养时间的长短有关；无性系变异是可以遗传的。

关于体细胞无性系变异的可能机理[55][56]，有染色体数目变异、染色体结构变异和基因突变三种解释。在玉米无性系变异比较系统的研究中，发现染色体结构异常的频率显著超过染色体数目的异常。并发现断裂频率最高的第9染色体上具有一种能够引起染色体断裂的转座子基因——Ds基因（dissociation基因），在另一种转座子Ac（Activator激活子）的作用下，可以在其所在位点发生染色体断裂；而Ds基因本身或者再带着一些基因转位到染色体的其他位点，同时染色体也发生结构上的改变。20世纪80年代以来许多研究者试图用这一转座子学说来解释无性系变异现象，主要论点如下：在组织培养过程中，细胞分裂速度很快，异染色质复制落后，结果在细胞分裂后期形成染色体桥及断裂；在断裂部位（异染色质区）DNA修复过程中，属于异染色质一部分的转座基因发生去甲基化，因而被激活，发生转座并引起一系列的结构基因活化、失活和位置变化，造成无性系变异。也有研究者推测存在相反的可能性，即在组织培养中由于某些化学因素（如外源植物激素）或物理因素使转座子（例如Ac转座子）激活，然后通过Ds转座子引起染色体断裂和结构变异。

体细胞无性系变异范围较广，单基因或少数基因变异的情况较多，这些变异可用来对现有品种进行有限的修饰与改良，例如降低株高、提早成熟、增强抗性或改进品质等。这些品种改良技术在国内外都有成功的范例。

1.3.6 组织培养与细胞编程死亡

细胞死亡可分为细胞坏死（necrosis）和细胞编程死亡（programmed cell death, PCD）两类[57]。前者起因于外伤或环境剧变等偶然因素；后者属生物体自身调控的生理性细胞死亡、细胞编程死亡或细胞凋亡（apoptosis）。多细胞生物体内经常不断地发生细胞的新陈代谢，一方面不断有新细胞产生和分化，另一方面老旧的、失去功能的、有害或多余的细胞不断地被排除而死亡。可是植物学界对于细胞死亡研究甚少，直到20世纪受到动物学和医学上对这一问题深入研究的影响，80年代才引起重视。Gahan评述[58]了20世纪60～70年代以来各类植物细胞，如根冠、绒毡层、木质部和韧皮部中管状分子、贮藏组织、通气道等形成过程中发生的细胞超微结构变化以及细胞衰老和临近死亡时呼吸作用的突然跃升和水解酶的扩散等现象，明确地指出这种现象属由遗传控制的自杀性的PCD。

这种借PCD实现的新、老细胞新陈代谢对于维持多细胞生物正常的生长发育（包括传粉授精、胚胎发育）甚至离体形态发生都是必不可少的。例如在裸子植物欧洲云杉（Picea abies）体细胞胚离体形态发生过程中有两次PCD发生高峰[59]：第一次高峰发生在增殖的前胚性细胞团（pre-embryogenic masses）晚期，当培养基中撤除生长素与细胞分裂素，激发前胚性细胞团解体和体细胞胚开始形成时；第二次高峰发生在早期胚胎发生和胚柄消失时。在被子植物胚体发育到心形期，胚柄完成其功能后通过PCD而解体。

进一步的研究揭示，PCD甚至在愈伤组织裂解和增殖过程中也起着重要作用。

胡萝卜悬浮培养的愈伤组织团块由中央的分生组织细胞团和周围的高度液泡化的细胞组成。分生组织细胞的分裂使团块内细胞数目增多，团块体积加大，其中又分化出许多液泡化的细胞使分生组织细胞团内部分割成几个亚单位；液泡化细胞的液泡化程度随着愈伤组织团块增长而增高。分生组织细胞团的亚单位之间的高度液泡化的细胞死亡导致愈伤组织团块裂解。只要2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）存在，胡萝卜悬浮培养的愈伤组织就在“生长—裂解—再生长—再裂解”的模式中循环往复[60]。PCD甚至影响由落叶松（Larix gmelini）未成熟胚衍生的不同类型的愈伤组织的外貌、质地和裂解方式。它的愈伤组织团块也主要由上述两类细胞组成，在活跃生长的疏松型愈伤组织团块的亚单位之间存在着高度液泡化的、染色深的细胞。这些细胞解体之后，一个大的愈伤组织团块裂解成几个小团块。这些高度液泡化的、染色深的细胞在原位末端标记（TUNEL检测）中呈阳性反应，证明它们经历了PCD[61]。落叶松的致密型愈伤组织团块中，发生PCD的细胞数目比疏松型愈伤组织少得多，而且多不形成连续条带，不易因其解体死亡而裂解，因此会长成大的团块。

1.3.7 极性和相关现象

极性即细胞、器官区分为上、下端的现象，就像磁铁一样，不受外植体切割大小和长短的影响，人为颠倒也不会改变它的极性，但可能影响胚胎或器官发生的速度和发育。在香雪兰（Freesia refracta）花序离体胚胎发生的研究[62]中，王丽等观察到体细胞胚总是发生在花序切段的形态学下端，而形态学上端无体细胞胚形成。他们发现培养初期内源激素IAA在形态学下端的积累和特异性多肽的生物合成，导致体细胞胚形成最初的细胞分裂。

相关现象中最常见的是顶芽与腋芽的相关。顶芽维持顶端优势，抑制侧芽伸展。欲通过组织培养加速繁殖可在采摘前事先摘除顶芽，促进腋芽萌动。但不同植物的顶端优势程度不同，易分蘖的禾本科植物顶端优势不明显，乔木的顶端优势比灌木明显。

1.3.8 植物的生理年龄

植物的生长与动物不同，为开放式顶端生长，由顶端分生组织不断产生新器官——幼叶和芽，芽伸展形成枝和叶。植物的幼年期和成年期常具有不同的特征，例如，二年生植物有以基生叶为特征的苗期（幼龄期）和以抽薹或抽穗为特征的成年期（成熟期）。这种情况在多年生木本植物，特别在乔木中表现得更为明显，即在扦插、嫁接等园艺实践中常常碰到的生理年龄问题。在木本植物中，生理年龄并不与器官形成的先后成正相关，乔木的树冠部位的枝条为成熟期，下部的枝条属幼龄期，树干基部或根部长出的萌蘖在生理上更年幼。与幼龄期枝条相比，成熟期枝条扦插或离体培养时不易生根，器官发生速度较慢。二者在激素含量上也有差异。组织培养实践证明，通过体细胞胚胎发生能够使已经老化的培养物复壮，恢复到幼龄状态。许多研究者认为生物的老化是由于在发育过程中失活的基因越来越多。基因失活的原因之一是染色体DNA的甲基化[63]。胞质对于细胞的成熟水平起重要作用。如将一个成熟细胞的核移植到幼龄期细胞的胞质中，细胞核往往可以向幼龄期逆转，使整个细胞复壮[64]。但是对于形成生理年龄及复壮的机理迄今还不很清楚。在组织培养，特别是多年生木本植物组织培养中必须注意植物生理年龄问题，它影响到培养的效率和成败。