第三节 亚细胞结构与骨架结构

与其他真核生物一样，弓形虫有着复杂的亚细胞和骨架结构。这些亚细胞结构大多是基于电子显微镜对弓形虫不同发育阶段的观察所得结果予以描述。通过对这些亚细胞结构和骨架结构的了解，可以从超微结构水平了解弓形虫细胞器的精细结构，从而有助于理解其功能。

一、细胞骨架：表膜（内膜复合体）、锥体和顶环

弓形虫细胞骨架包括虫体前端顶复体（apical complex）中的锥体和极环、以及其作为微管组织中心向虫体外周发散产生22条长度约虫体三分之二的外周微管纤维为核心，与内膜复合体、质膜和基底复合体共同构成。虫体内膜复合体（inner membrane complex，IMC）在虫体里面与微管纤维紧密结合，形成扁平的囊泡膜结构，该结构紧贴极环起始，向虫体后端有规律地排列，在后端与基底复合体（basal complex）相邻。在内膜复合体外侧是虫体的质膜，由于电镜通常能看见三层膜结构，因此，这三层膜结构也合称为表膜（pellicle）。

1.表膜

弓形虫表膜由3层膜构成，包括外层的细胞质膜，以及其内两层形如囊泡的扁平膜构成，囊泡状的扁平膜结构称为内膜复合体（inner membrane complex，IMC），该膜结构是动态的，并由多个独立的囊泡膜区块缝合，而在虫体外周形成一个完整的囊泡膜结构。IMC两层扁平囊泡膜内间隙约15nm，IMC囊泡内部和膜上存在大量蛋白质，而靠近质膜侧包含肌动蛋白-肌球蛋白为基础构成滑移运动复合体的锚定位点，为虫体提供结构支撑和动力来源。而在IMC囊泡细胞质侧存在一个膜下蛋白质网络，称为膜下网络（subpellicular network，SPN）。IMC囊泡环绕整个虫体，并在虫体的前端和后端各有一个开口，分别与极环和基底复合物相邻（图2-10）。冷冻电镜观察发现，内膜复合体两侧的表面被大小一致的内膜颗粒（inner membranes particle，IMP）所覆盖，IMP在膜表面被组织成22行高度规则的二维晶格化颗粒蛋白，每行由两个相距一小段距离且平行的IMP组成。这些高度规则的IMP从IMC的顶端区域向外辐射，与22条膜下微管相对应。除顶端区域之外，在IMC上排列的IMP之间还分布有单行的IMP，而且两行IMP之间的距离会在向后延伸时随弓形虫的直径变宽而增加，并且其中间的单行IMPs的数量也会增加以维持两行之间增加的空间大小不变，IMP在IMC上的排列一直延伸到虫体的后端。在弓形虫内膜复合体细胞质侧分布着膜下微管，膜下微管覆盖着厚度约32nm微管相关蛋白（microtubule-associated protein，MAP）。事实上，IMC上每行IMP也都是以32nm的间距均匀地分布在内膜复合体上。这些精细的结构表明，MAP通过IMP的相互作用协调了膜下微管与IMC的组织。

弓形虫表膜上有一个位于细胞顶端和中部之间，通常在细胞核位置之前向内凹陷的圆形微孔（micropore）。微孔是在顶复门原虫中某些种类质膜上发现的微小杯状结构，由质膜向内凹陷而成，可能参与寄生虫对营养物质的摄取。Garnham等先后在疟原虫的裂殖子及弓形虫的缓殖子和速殖子阶段观察到微孔结构。微孔通常位于弓形虫的前部，数量为1～3个不等。Nichols等在对弓形虫微孔的超微结构研究中，用辣根过氧化物酶与弓形虫速殖子共同孵育，观察到被辣根过氧化物酶标记的微孔下方形成的出芽和内吞现象。随着弓形虫内溶酶体样细胞器的发现，并观察到宿主细胞质中表达的GFP可被摄入并累积在内溶酶体样细胞器中，间接表明了弓形虫存在内吞作用，以摄取宿主源大分子蛋白的可能性。典型的细胞内吞过程常由网格蛋白、接头蛋白、ENTH结构域蛋白等蛋白质参与。然而，在弓形虫微孔中并没有发现这些蛋白质的定位，但在电镜中观察到了纤维样包被，说明在微孔结构中存在结构性和功能性的蛋白质。但是，微孔是否具有内吞作用，目前仍需进一步研究（图2-10）。

2.顶复体

顶复体（apical complex）是顶复门原虫特有的，位于极性前端的亚细胞结构，狭义上，顶复体是该门原虫分类的重要依据。然而，其结构相对较为复杂，在球虫亚纲和隐孢子虫亚纲中顶复体结构完整，包含顶极环（apical polar ring，APR）、锥体（conoid）、锥体前环（pre-conoid ring）、以及类内锥体微管（intraconoid microtubule）。顶极环在锥体下方，中空并绕虫体成圈排列，与IMC囊泡相邻。锥体呈篮球圈吊篮状，中空半圆锥体样。锥体前环位于锥体最前端，呈环状结构。内锥体微管是中空锥体内部的纤维结构。

这些结构最基本的构成是微管，特别是顶极环和锥体，在电镜下可以观察到致密的排列有序的纤维结构，其基本成分是微管纤维。因此，顶复体是虫体内细胞骨架的核心构成部分。事实上，顶极环和锥体是虫体微管组织中心（microtubule organizing center，MTOC）。虫体的外周微管从顶极环向虫体外周表膜下方延伸，在弓形虫虫体中形成了22根表膜微管，这22根微管表膜微管连同顶极环和类锥体构成了弓形虫的细胞骨架。

顶极环与锥体前环合并称为极环（polar ring），锥体前环有时称前极环（anterior polar ring），而顶极环有时则称为后极环（posterior polar ring），不同文献表述会有差异。顶复体中各亚结构的相对位置会移动；而顶极环则相对稳定，而当虫体寄生在宿主细胞内的生长阶段，锥体和锥体前环处于虫体内，即顶极环下方。然而，当虫体受到钙信号刺激后，比如钙通道载体A23187处理，可诱使锥体和锥体前环延伸向前突出，使其出现在顶极环的外侧，该状态常称为类锥体凸起（conoid protrusion）。锥体凸起被认为是虫体内微线体分泌的前提条件，因此锥体凸起是虫体逸出、滑移运动和侵入宿主细胞所必需的，其原因目前尚未知晓，可能与微线体分泌位点有关系，但也有人认为锥体凸起与微线体分泌无直接关系。在锥体凸起状态时，内膜复合体的边界与顶极环相接；而顶环的钝性突起支撑表膜微管与顶极环的横向结合，使表膜微管的基部在周围的轮状突起之间均匀分布，因此其结合部分在横切面上呈现齿轮状（Weiss and Kim，2013）。

锥体凸起状态时，微管纤维清晰可见，呈吊篮形状，大小在250～400nm之间。显微研究发现其由14根微管纤维从顶极环螺旋，完成约半周螺旋后与锥体前环交汇，其螺旋纤维与顶极环呈35°～50°角。此外，锥体的微管纤维在结构上与顶极环完全不一样，锥体微管纤维由9根原纤维构成，排列呈开环逗号左螺旋形态。因此，这种原纤维的排列方式及微管纤维以螺旋方式构成锥体必然在结构上存在物理性张力，是一种不稳定的状态。可以推测该结构将存在多种结构性和功能性的蛋白，以稳定和执行其功能。

3.基底复合体

弓形虫的基底末端存在一个独特的细胞骨架装配结构称为基底复合体（basal complex）。其功能相当于一个真核细胞复制到最终阶段完成胞质分裂所需要的收缩环，在子代细胞发育成熟后将子代细胞分割开。与其他生物细胞分裂完成后收缩环会解体消失相反，弓形虫体内成熟的基底复合体是一种永久性的细胞骨架结构，位于速殖子的后部，持续在维持内膜复合体的闭合中发挥作用（图2-11）。

4.分裂余体

弓形虫速殖子在入侵细胞后进行第一代增殖后会在细胞后端形成一种称作残体（residual body，RB）的结构。纳虫泡内每个子代细胞的后端均与分裂余体连接。分裂余体膜是来自母体细胞膜的一部分。分裂余体是由速殖子后端内陷分泌形成的，呈球形，直径大约1μm，无序分布在纳虫泡内。纳虫泡内的速殖子增殖过程中，其大小无明显变化。透射电镜和扫描电镜均显示速殖子外膜与分裂余体膜相接。分裂余体内容物包括来自母体内质网膜、线粒体等器官的残留物。分裂余体的形成需要肌动蛋白（actin）的参与，缺乏肌动蛋白的弓形虫不产生分裂余体。分裂余体的作用和IVN类似，被认为有助于组织虫体的花瓣状形状，有利于弓形虫有效地利用空间以及维持细胞分裂同步进行。分裂余体内也发现存在一定数量的钙酸体（acidocalcisome），而且这些钙酸体会进行融合，最终将其内容物释放到纳虫泡空间内。钙酸体内存在的大量钙离子以及磷聚合物也同样在分裂余体内检测到。钙酸体内容物的释放可能有助于速殖子逸出时的分离。肌球蛋白TgMyoI也主要位于分裂余体中心，而TgMyoJ则定位在每个速殖子的底部周围。抑制TgMyoI和TgMyoJ的表达会导致Ca2+依赖蛋白激酶TgCDPK2的失活，从而导致弓形虫底部复合物不能收缩，子代细胞不能完成胞质分裂和逸出，同时也失去了细胞分裂的同步性，细胞不能附着在分裂余体，而且在分裂余体内发现大量堆积的支链淀粉颗粒。

5.膜下微管

弓形虫的微管位于内膜复合体下，共22条缠绕虫体约三分之二的长度，呈螺旋状排列，单条微管有明显的横纹，这些微管是传统的直径22nm的中空微管，由13个微管蛋白制成的纤维组成。

6.细胞骨架元件

（1）微管组织中心：

弓形虫共有4个微管组织中心，位于顶部的极环和锥体，以及一个非典型的中心体以及细胞分裂时出现的中心锥体（centrocone）结构。在成熟的虫体内，弓形虫内的膜下微管的负端锚定在顶端的微管组织中心极环上，从虫体的顶部末端向后端延伸，而正末端游离，处于解聚的状态。

（2）α和　β微管蛋白：

α和β微管是由α和β微管蛋白异质二聚体亚基聚合而成。弓形虫基因组存在编码三种α微管蛋白亚型和三种β微管蛋白亚型的基因。α1微管蛋白基因（TGME49_316400B）在速殖子和卵囊内表达丰富；α2微管蛋白基因（TGME49_231770）在速殖子中低表达，在卵囊中高表达；α3-微管蛋白基因（TGME49_231400A）在速殖子和卵囊中表达。这3种不同亚型的a-微管蛋白具有明显不同的氨基酸序列（同源性为40%～70%）。β1微管蛋白基因（TGME49_266960）、β2微管蛋白基因（TGME49_221620）和β3微管蛋白基因（TGME49_212240）在速殖子和卵囊内均表达且序列非常相似（同源性约为98%）。

二硝基苯胺可以选择性地与植物或原生动物的微管蛋白结合，但不与脊椎动物的微管蛋白结合，从而抑制弓形虫微管的聚合。实验证明弓形虫α1微管蛋白的单点突变可以使自身产生对二硝基苯胺处理的抗性，说明弓形虫内的微管主要由α1微管蛋白组成。微管蛋白二聚体存在大量的翻译后修饰，并且细胞内不同器官的微管亚群的修饰各有不同。纺锤体微管、中心体和鞭毛丝上的α1-和β1-微管蛋白通常是谷氨酰胺化的，α-微管蛋白亚基K40位点可以被乙酰化，其C末端可以进行去酪氨酸化的可逆修饰以及删除最后两个残基（D2）的不可逆修饰。α-和β-微管蛋白的C末端都可以进行谷氨酰胺化或糖基化的可逆化修饰。而在速殖子中，微管蛋白存在其他生物体中未发现的微管蛋白修饰，如α1-和β1-微管蛋白的羧基末端可以甲基化，α1-微管蛋白的最后5个氨基酸（YGDEY）可以被截断。弓形虫微管的这些不寻常的微管蛋白修饰，可能与特殊的微管蛋白结构（如锥体和鞭毛丝）的作用有关。虽然翻译后修饰可能直接影响微管的稳定性，但大多数证据表明翻译后修饰改变了微管与相关蛋白的相互作用，进而影响了微管对药物的相对敏感性，这些修饰可能也解释了弓形虫微管在高压、低温和解聚处理下的稳定性。

（3）微管相关蛋白（microtubule associated protein，MAP）：

弓形虫至少有5种含有微管蛋白的结构：纺锤体、膜下微管、锥体内微管、中心粒和锥体。但是它们都可能包含独特的微管相关蛋白。质谱检测发现顶端极环、锥体和膜下微管中存在许多可能与弓形虫速殖子膜骨架相互作用的多肽，其中一些被认为与微管相关，包括TgICMAP1、内膜复合体蛋白TgIMC4、TgSPM1、TgSPM2、中心体蛋白TgCen2和TgCen3以及一个动力蛋白轻链TgDLC1。TgICMAP1（TGME49_239300）是一个135kD大小的蛋白，定位于锥体内微管。它包含一个SMC-样结构域位点，该位点的突变实验表明其参与锥体内微管的定位，体外实验和哺乳动物细胞的异位表达都表明TgICMAP1直接与微管结合。TgSPM1（膜下微管1，TGME49_263520）定位于整个膜下微管而不定位于其他结构，TgSPM1的缺失会降低弓形虫的稳定性。与正常虫株相比，敲除虫株的膜下微管增加了对去垢剂的敏感性。TgSPM2（膜下微管2，TGME49_286590）定位于膜下微管的中部区域，该蛋白是非必需蛋白，它的缺失不影响弓形虫速殖子的增殖以及其在体外的整体适应性。TgEB1（TGME49_227650）在子代细胞复制早期分散于细胞质中，在中心粒复制时会出现在中心粒之间，但不与复制的中心粒重合而与有丝分裂微管末端共定位。随着子代细胞的继续生长，TgEB1位于复制的中心粒附近，并扩散到生长的子代的细胞质中。

（4）微管马达（microtubule motor）：

微管马达是多亚基复合物，利用ATP水解释放的能量沿微管移动。驱动蛋白（kinesin）一般向微管正端移动，而动力蛋白（dynein）则向微管负端移动。弓形虫基因组有许多编码驱动蛋白和动力蛋白亚基的基因，但除了已知动力蛋白轻链TgDLC1定位于速殖子纺锤体、中心粒、基底复合物和锥体外，其余蛋白的定位和功能均未知。

（5）中心体定位蛋白：

在弓形虫中已鉴定出三种中心体蛋白的亚型，其中TgCen1（TGME49_247230）和TgCen3（TGME49_260670）具有中心体中心蛋白（赖氨酸和精氨酸残基的规则分布以及N末端20个残基中的疏水性氨基酸）的典型特征，而TgCen2（TGME49_250340）则缺少这些特征。在速殖子中，TgCen1只定位于中心粒/中心体，而TgCen3主要存在于中心体中，在锥体中少量存在。而TgCen2定位在中心粒、顶帽结构最下端的环、顶端和基底末端。

条纹纤维次晶蛋白（striated fibre assemblin，SFA）是条纹微管相关纤维的主要成分，这是一种不可收缩的纤维，在绿藻中与基体和微管结合，参与鞭毛的形成。弓形虫基因组中存在编码在速殖子中表达的TgSFA2和TgSFA3以及三个SFA的同源物（TGME49_307840，TGME49_205670和TGME49_218880）的基因。弓形虫速殖子中，用SFA抗体标记发现弓形虫SFA与中心粒的中心体蛋白共定位，信号出现在中心粒复制后不久并在细胞周期后期逐渐降解，并在分裂间期信号消失。SFA纤维从中心粒中伸出，将中心粒与子代细胞顶端的极环和锥体系在一起。SFA2或SFA3的缺失都会抑制顶极环的生成，从而抑制子代细胞的产生，由于核分裂不受影响，所以会出现多核的现象。这些结果表明，虽然弓形虫的无性阶段没有建立鞭毛结构，但它们保留了SFAs作为一种手段来确保复杂细胞器的可靠遗传。

SAS-6是一种普遍存在的中心体定位蛋白，在许多生物中心粒的早期发生过程中，SAS-6被证明参与了中心粒的侧翻。弓形虫仅有一个SAS-6同源基因（TGME49_306430），在细胞复制过程中定位于中心粒和细胞质内。

内膜复合体蛋白IMC15（TGME49_275670）的定位在中心粒与IMC之间周期出现。在细胞周期开始时，它首先与复制的中心粒结合，随着复制的进行重新定位到新生子代细胞的IMC中。这一现象表明，IMC15可能起着调节子代细胞数量的作用，并确保它们在正确的时间开始发育。

Tg14-3-3（TGME49_263090）是弓形虫基因组中四种14-3-3蛋白之一，它在弓形虫中定位于子代细胞的基底复合物和中心粒。14-3-3蛋白家族是一组保守的调控分子，与多种信号蛋白如激酶和磷酸酶结合，类似于它们在其他真核生物细胞周期调控中的作用，可能调控子代细胞的发育。

（6）锥体蛋白：

弓形虫含有一个类似于SAS-6的相关蛋白（SAS6L），定位于锥体前环上的区域。SAS6L的缺失会导致弓形虫速殖子的适应能力降低，而通过标记YFP证明SAS6L的表达升高则会显著导致胞质内纤维形成，表明其可能与纤维组装相关。同时TgDLC1和TgCen3也定位于锥体。

（7）极环蛋白：

TgRNG1（TGME49_243545）是一种小的、低复杂性的、洗涤剂不溶性的蛋白质。该蛋白定位于弓形虫极环，是极环发育后期，仅在核分裂完成和子代细胞相当成熟后才出现的蛋白。

（8）内膜复合体蛋白：

内膜复合体上分布着一系列的蛋白。首先是内膜复合体（IMC）蛋白，它们是定位于IMC膜下网络上的蛋白，这些蛋白可能增加弓形虫拉伸的强度，类似多细胞生物中的丝蛋白的功能。已知IMC蛋白至少包括15种，即IMC1-15。IMC1（TGME49_231640）是第一个被发现的IMC蛋白，可增加子代细胞IMC膜下网络的稳定性。不同的IMC蛋白在母代和子代的细胞骨架上表现出独特的定位模式和表达水平，TgIMC1和TgIMC4（TGME49_231630）在母代和发育中的子代细胞中表达水平相当。相比之下，TgIMC3（TGME49_216000）、TgIMC6（TGME49_220270）和TgIMC10（TGME49_230210）的分布则向发育中的子代细胞倾斜，随着子代细胞的出现和成熟，这些蛋白的浓度逐渐降低。除了TgIMC7（TGME49_222220）、TgIMC12（TGME49_248700）和TgIMC14（TGME49_260540）外，弓形虫的其余IMCs基因均在子代出芽时表达达到最高峰。TgIMC14在出芽后1小时达到最高峰，而TgIMC7和TgIMC12在G1和S期之间表达量最高。TgIMC7、TgIMC12和TgIMC14在G1期仅在母体的细胞骨架上出现，由于此时子代细胞骨架已完全形成，这些蛋白可能起着将母代细胞骨架与成熟的子细胞骨架区分开的作用，以便在后期发育过程中选择性地解体母体细胞骨架。TgIMC5（TGME49_224530）、TgIMC8（TGME49_224520）、TgIMC9（TGME49_226220）和TgIMC13（TGME49_253470）在弓形虫分裂期间定位会发生改变，在子代细胞刚出芽时，它们沿着整个子代细胞分布，但随着时间的推移，它们会转移到成熟的子代细胞基底复合体中。单个IMC蛋白在基底复合体的定位也存在差异，基底复合体最大的区域由TgIMC9，TgIMC13和TgIMC15（TGME49_275670）以及MORN1占据，TgIMC5和TgIMC8则环绕一个小的区域，基底最后端由TgCen2分隔。TgIMC5、TgIMC8、TgIMC9和TgIMC13从出芽子代到基底复合体的移动与TgCen2在基底复合体上的装配是同时进行的，说明它们可能与TgCen2和其他基底复合体组分相互作用来形成细胞骨架的基底端。有趣的是，TgIMC15最先定位于复制的中心粒上，随后才向出芽子代细胞骨架转移，TgIMC15与复制中心粒的联系可能协调其他关键因子的募集从而起动子代细胞的装配。目前，利用CRISPR/Cas9等基因编辑技术可以详细了解这些蛋白的功能。但是，我们必须清晰地认识到，生物系统是个极为复杂多变的网络系统，只有通过多方面的严谨分析才能真正了解其本质。

IMC亚间隔蛋白（IMC subcompartment protein，ISP）是弓形虫分裂过程中出现在IMC的不同区域的蛋白。TgISP1（TGME49_260820）定位于弓形虫的顶部，是子代细胞开始构建时最先看到的蛋白标志之一。TgISP2（TGME49_237820）和TgISP4（TGME49_205480）定位于IMC的中部，而TgISP3（TGME49_316540）则定位于基底。ISPs不属于IMC细胞骨架网络的一部分，因为他们很容易在温和的洗涤剂条件下提取。相反，它们可以通过在蛋白末端的肉豆蔻酰化和棕榈酰化来固定在IMC的囊泡膜上。敲除弓形虫ISP1后，尽管其并未出现异常表型，但ISP2/3被错误定位到顶帽区域，说明ISP1可能是阻止其他家族蛋白进入顶帽的作用。ISP2/3的错误顶端定位也可能为了补回ISP1敲除所导致的功能缺失。敲除ISP3也没有发生明显的变化，但敲除TgISP2则会导致弓形虫的复制紊乱，在一个虫体内复制多个子代细胞，说明TgISP2对弓形虫的正常分裂起到关键的作用。

最近，通过亲源性生物素标记（BioID）技术也发现一些新的定位在IMC的蛋白（Chen等，2015），并根据其在IMC上的排列命名为呈横向和纵向排列的IMC缝合组分（IMC sutures components，ISC）以及只横向排列的横向缝合组分（IMC transverse sutures components，TSC）。除了ISC3（TgME49_220930）与胆碱转运蛋白相似，对ISC1（TGME49_235340）、ISC2（TgME49_219170）、ISC4（TgME49_305930）、ISC5（TgME49_202930）和ISC6（TgME49_267620）的同源比对发现，它们没有任何明显的功能位点。ISC 1/4似乎嵌入在IMC细胞骨架中，但通过预测，它们也具有将自己附着在细胞膜上棕榈酰化的位点。ISC2是可溶的，尽管它缺乏预测的跨膜结构域或酰化位点，但它可能间接地附着在IMC膜或与细胞骨架相互作用。ISC3包含8个预测的跨膜结构域，是一个跨膜蛋白。ISC5完全耐洗涤剂提取，并与细胞骨架标记物IMC1共定位，表明它嵌入在IMC的细胞骨架网络中。ISC6似乎与IMC膜有关，因为它在去垢剂的作用下是几乎完全溶解的，这与预测的蛋白质C端三个跨膜结构域的存在是一致的。在子代发育过程中，每个ISC都可以在子代的IMC上检测到。与其他ISC相比，在出芽的子代细胞中ISC3表达量最为显著。敲除ISC3蛋白，发现弓形虫出现形态以及体外适应性缺陷，并且对小鼠的毒力丧失。定位在横向结构的TSCs共有6个，CBAP/SIP/TSC1（TGME49_267500）、TSC2（TgME49_239800）、TSC3（TgME49_230850）、TSC4（TgME49_272520）、TSC5（TgME49_232260）和TSC6（TgME49_294340）。去垢剂提取分析表明，与ISCs一样，TSCs含有与IMC的细胞骨架（TSC2/3/4）或膜（TSC5/6）相关的蛋白。

除了上述的蛋白外，还有一些其他蛋白定位于内膜复合体，如弓形虫IMC定位蛋白1（TgILP1，TGME49_313380）和TgPhIL1（TGME49_258410）。TgILP1是一种不溶于去垢剂，在顶复门中高度保守的IMC定位蛋白。TgILP1在母代和子代细胞上均有定位，过表达TgILP1-YFP导致弓形虫出现畸形的细胞骨架和不规则的细胞核。TgPhIL1定位于速殖子的表膜，集中在虫体的顶部和基底部，在速殖子复制过程中，TgPhIL1定位于子代细胞顶端的IMC并随子代细胞的组装向后延伸（表2-1）。

（9）TgMORN：

MORN是23个氨基酸长度的保守位点，在细菌和真核生物蛋白中均有发现。真核细胞的MORN蛋白协调膜与膜或细胞骨架的相互作用。弓形虫有2个MORN-repeat蛋白，TgMORN1（TGME49_310440）和TgMORN2（TGME49_292120）。TgMORN1在顶复门中高度保守，而TgMORN2在其他顶复门寄生原虫中没有明确的同源基因。TgMORN1的定位会在复制速殖子内的几个亚细胞位置动态地变化。它首先定位于核膜的一个特殊区域中心锥体（centrocone）和两个代表子芽出现的环中，随着染色体的复制，TgMORN1伸长并一分为二，与有丝分裂纺锤体的两极共定位。两个子代环的尺寸增大，每个环又分裂为一个顶环和一个后环，这些环决定了新生的两个子代IMC的顶端和后端。后端的TgMORN1环限定在延长IMC结构的前端，并在内出芽过程中延伸并形成“U形”包围核的两个臂，最终挤压分裂细胞核后继续向后延伸到虫体后端。弓形虫在猫的小肠上皮细胞进行多内出芽增殖时，在母代细胞的胞质内可以观察到多个含有MORN1的环，与在速殖子中的功能类似，当复制进行的时侯可限定子代新生IMC的组装。TgMORN1的条件性缺失会抑制基底复合体的组装，导致复制异常。TgMORN1的相互作用蛋白已被纯化和质谱鉴定出来，包括TgMSC1a、Tg14-3-3和TgILP1。TgMSC1a（TGME49_216650）与定位在后环的TgIMC5和TgIMC8共定位，与基底的TgMORN1信号基本不重叠。值得注意的是，TgMSC1a是成熟基底的第一个独特标记蛋白，因为它没有标记在发育中的子代细胞的基底复合体，它在弓形虫有一个同源基因TgMSC1b（TGME49_202390），而且它们之间具有36%的序列相似性。TgMSC1b定位在成熟细胞的表膜，只能在成熟细胞骨架中检测到。

通过酵母双杂交实验鉴定出两个与MORN1共定位的蛋白HAD2a（TGME49_289910）和HAD2b（TGME49_246110），它们都包含一个卤酸脱卤素酶（haloacid dehalogenase，HAD）位点。HAD2a和b在体外都被证明具有酶活性。HAD2a定位于新生的子芽，在基底复合体收缩时与MORN1共定位到其上。条件性敲除HAD2a会干扰基底复合体的装配，导致不完全的胞质分裂，子代细胞不能分离，最终破坏弓形虫的正常增殖，而HAD2b则可以与MORN1结合并定位到IMC的顶端与锥体相接处。

（10）肌动蛋白、肌动蛋白样蛋白和肌动蛋白结合蛋白：

弓形虫基因组有一个单独的肌动蛋白亚型（TgACT1，TGME49_209030）基因，以及许多肌动蛋白样蛋白（ALP）和肌动蛋白相关的蛋白（Arp）。同源比对也发现弓形虫基因组编码一些保守的肌动蛋白调控蛋白如成丝蛋白（formin）、组装抑制蛋白（profilin）、丝切蛋白（ADF/cofilin）、成帽（capping）蛋白、环化酶相关蛋白和冠状蛋白（coronin）。

肌动蛋白是真核细胞中最丰富的蛋白质之一，它以单分子球状肌动蛋白（G-actin）形式存在。球状肌动蛋白通常通过缓慢成核时期和一个快速的延伸时期聚集成丝状称为丝状肌动蛋白（F-actin）。肌动蛋白丝对弓形虫的运动十分重要，弓形虫基因组含有一个单独的肌动蛋白基因TgACT1，条件性敲除TgACT1会严重影响弓形虫的运动、入侵和逸出，但弓形虫仍然可以繁殖数天，说明可能存在不依赖肌动蛋白的运动方式。

系统演化分析结果表明，弓形虫至少有10组不同的肌动蛋白包含保守的肌动蛋白结构域。一些蛋白质是Arp的同源物，其他的（如ALP）则是顶复门寄生原虫所特有的。Arp在真核细胞中高度保守并调节细胞骨架和染色质重构，典型的真核生物肌动蛋白相关蛋白与肌动蛋白的整体序列相似，它们的功能包括调节微管马达的激活（Arp1、Arp10和Arp11），肌动蛋白聚合（Arp2和Arp3），染色质重塑（Arp4、Arp5、Arp6、Arp7、Arp8、Arp9）。值得注意的是，虽然传统的真核生物使用保守的Arp2/3复合物来调节肌动蛋白骨架，但弓形虫缺乏Arp2和Arp3蛋白以及编码其复合物的p34、p21和p16亚基的基因。弓形虫这10种不同的肌动蛋白相关蛋白中，有3种是Arp1、Arp4和Arp6的同源基因。Arp1是激活微管马达中动力蛋白的激活蛋白复合物的保守组分，并协调微管马达与货物的相互作用。弓形虫基因组还包含一个Arp6基因和两个Arp4同源基因：Arp4a、Arp4b、Arp4和Arp6都是保守的核蛋白，Arp4是染色质重组和组蛋白乙酰转移酶复合物的组成部分，TgArp4a中的I621T突变会导致Arp4a蛋白的不稳定和错误定位，进而导致核分裂时染色体丢失，速殖子生长停滞。肌动蛋白相关的10个蛋白群剩余7个是顶复门特有的肌动蛋白样蛋白（ALP），包括ALP1、ALP2a、ALP3b、ALP8和ALP9的两种形式：ALP9a和ALP9b。TgALP1与传统的肌动蛋白关系最为密切，在子代弓形虫的细胞分裂过程中可能参与子代细胞膜的形成，TgALP1可以在分散和聚合的形式之间相互转换，定位到核膜的一个离散区域、转运囊泡和子代虫体早期的IMC上。过表达ALP1会干扰子代虫体IMC的形成并导致核和顶质体分离出现缺陷。

虽然真核生物通常使用Arp2/3复合物来启动肌动蛋白聚合，但在弓形虫中，F-actin聚合是由3种成蛋白（formin）介导的。TgFRM1和TgFRM2独立促进肌动蛋白聚合，FRM1定位于弓形虫的顶端，它可能是在弓形虫的顶端产生F-actin以起始运动。内源性蛋白标记发现FRM2定位于顶端近核区，而FRM3则出现在于基底和分裂余体内。FRM2负责在顶部近核区域产生F-actin，并参与顶质体的遗传，而FRM3在分裂余体中产生F-actin，通过维持细胞间的通讯来确保分裂的同步性。FRM1的作用是产生仅在细胞外的弓形虫中出现的肌动蛋白丝，使其能够滑动、入侵和逸出。

其他真核生物中，抑制蛋白（profilin）在调节肌动蛋白聚合中起着复杂的作用，虽然它们能隔离肌动蛋白单体以促进解聚，但它们也能增强核苷酸交换以增加ATP-肌动蛋白的量以促进聚合。与其他真核生物不同，弓形虫的抑制蛋白（TgPRF，TGME49_293690）有其独特的特性。由于TgPRF只微弱地抑制核苷酸的交换以及在TgFRM1和TgFRM2上的FH1和FH2位点刺激TgACT1聚合的作用，说明其主要作为一个单体隔离蛋白起作用。条件性敲除PRF可影响弓形虫的运动性和入侵，完全敲除PRF的弓形虫对小鼠毒性减弱，而且弓形虫在入侵后不再诱导免疫细胞产生IL-12。

ADF/cofilin家族蛋白调节许多真核生物的肌动蛋白驱动过程（例如极性、迁移和解聚）。弓形虫内存在单一的ADF同源物，和其他真核生物的ADFs同源比对表明，其参与球形肌动蛋白（G-actin）结合的残基大部分是保留的，而与纤维状肌动蛋白（F-actin）相互作用所需的氨基酸则缺失。重组的TgADF（TGME49_220400）对ADP-肌动蛋白具有较高的亲和力，切断微丝的能力有限，而且与其他ADF不同的是，它不会与抑制切断活性的磷脂酰肌醇二磷酸（PIP2）相互作用。虽然TgADF与微丝没有显著的协同作用，但它能够诱导纤维状肌动蛋白以剂量依赖的方式解聚。TgADF条件性敲除会导致纤维状肌动蛋白的积累以及导致弓形虫出现缓慢的、不活跃的蛇形运动和摇摆。由于肌动蛋白丝的不稳定，速殖子的运动、入侵和逸出均受到抑制。在弓形虫的缓殖子中，TgADF的活性可能是通过与脱氧核糖磷酸醛糖样蛋白（TgDPA）的相互作用来调节的，因为重组TgDPA增强了TgADF解聚微丝的能力。

纤维状肌动蛋白中的成帽蛋白是由α和β两个亚基组成的保守的异质二聚体，与肌动蛋白丝的正端结合，阻断该位点的亚基交换。弓形虫基因组包含一个与β亚基具有明显同源性的基因TGME49_219290和一个较不保守的α亚基假定同源基因TGME49_208390。顶帽蛋白在敲除β亚基基因的伯氏疟原虫（Plasmodium berghei）中证明，虽然疟原虫可在红细胞内正常发育，但雌配子体活力降低，导致其在媒介按蚊体内卵囊和子孢子数量明显减少，从而降低疟原虫的传播概率。

环化酶相关蛋白（cyclase-associated protein，CAP）是一类保守的肌动蛋白结合蛋白，它们包含一段保守的C端肌动蛋白结合位点以调节肌动蛋白对细胞信号的反应。CAP与球状肌动蛋白（G-actin）结合以控制单体肌动蛋白的可用性。弓形虫的CAP同源蛋白与酵母和脊椎动物中的同源蛋白相比，体积要小得多，并且缺少腺苷酸环化酶结合域。TgCAP（TGME49_310030）C端融合标记YFP，发现其定位在表膜的顶端内侧。子代细胞在发育后期逸出母体之前，TgCAP被整合到子代细胞的顶端区，这种现象与顶极环的标志蛋白TgRNG1相似。TgCAP的定位取决于所在环境，在细胞内的速殖子中，TgCAP与顶帽区标记物TgISP1共定位；但在胞外，TgCAP的定位则向速殖子的细胞质移动。这表明，在细胞内TgCAP可能被隔离以防止细胞内寄生虫的运动；但在细胞外，TgCAP被释放到细胞质中，可能起调节肌动蛋白相关的运动作用。

冠状蛋白（coronin）是一种广泛存在于真核生物，含有WD-repeat位点的肌动蛋白结合蛋白。相对于其他的冠状蛋白，弓形虫的冠状蛋白（TGME49_216970）具有C末端延伸，其中含有SMC结构域和潜在的微管结合域。不过，目前有关弓形虫冠状蛋白的亚细胞分布和功能还不清楚。

（11）肌球蛋白（myosin）：

肌球蛋白是移动F-actin聚合物的分子马达，由驱动运动的重链和起调节作用的轻链的组成，功能主要是参与细胞分裂、囊泡运输、吞噬和细胞器运动。肌球蛋白重链通常包含头部、颈部和尾部结构域。头部区域负责协调肌动蛋白结合、ATP酶活性和运动的产生，颈部区域通常与调节运动的肌球蛋白轻链相互作用，而可变的尾部区域与运输的分子结合以保证运动的特异性。真核生物肌球蛋白重链按其头部结构分为18个系统演化类群，而弓形虫基因组包含11个肌球蛋白（TgMyoA至TgMyoK），其中许多属于第ⅩⅣ类群。系统演化分析将ⅩⅣ类群内再分为四个亚群，TgMyoA（TGME49_235470）和TgMyoD（TGME49_263180）分为ⅩⅣa、TgMyoB/C（TGME49_255190）和TgMyoE（TGME49_239560）分为ⅩⅣb、TgMyoH（TGME49_243250）属于ⅩⅣc，有些纤毛虫的肌球蛋白则被分为ⅩⅣd。ⅩⅣa-b组肌球蛋白缺少尾部结构域，ⅩⅣc具有一个可能作为鸟嘌呤核苷酸交换因子的ATS1位点。TgMyoH有6～8个IQ位点，这个位点可以在缺少钙离子的情况下结合钙调蛋白，TgMyoF（TGME49_278870，类群XXII）有3～6个IQ位点和一个WD40域，TgMyoG（TGME49_314780，类群XXIII）有一个MyTH4结构域，带有MyTH4和FERM结构域的肌球蛋白可以与微管结合。TgMyoI（TGME49_230980，类群ⅩⅣ）和TgMyoK（TGME49_206415，类群VI）肌球蛋白的特征是两个IQ序列和螺旋结构域，TgMyoJ（TGME49_257470，类群VI）则缺乏上述特征。TgMyoB、TgMyoC和TgMyoD在弓形虫缓殖子中的表达量比在速殖子更为丰富。

弓形虫肌球蛋白TgMyoA位于质膜和IMC之间，对速殖子运动至关重要。它是一种快速的单头肌球蛋白，以单一的步骤向肌动蛋白丝的正端移动，具有与快速的骨骼肌肌球蛋白相似的生化特性。MyoA的头部与F-actin结合依赖于ATP的产生，而其C端则可以与表膜充分地结合。该区域内的两个精氨酸残基（R814和R815）对MyoA的定位至关重要，用丙氨酸取代精氨酸会使TgMyoA定位出错，从而从膜定位转移到细胞质。TgMyoA已被证明有两个相关轻链：TgMLC1（TGME49_311260）和TgELC1（TGME49_269442）。TgMyoA缺少转运货物的尾部分子马达区域，该功能由TgMLC1以N端扩展的部分执行。TgMyoA中一个退化的C-端IQ基序可以与TgMLC1中的一个钙调蛋白样结构域结合，而TgMLC1的N端与TgGAP45的C端结合来定位分子马达到IMC上。TgMyoA与TgELC1的结合可能直接受Ca2+的介导并通过磷酸化来行使作用。条件敲除TgMyoA的弓形虫，其运动力降低，入侵和逸出比例减少，在体外培养条件下不能形成噬斑。TgMyoD是第二个ⅩⅣa肌球蛋白，较小，但与TgMyoA关系密切。尽管TgMyoD具有与TgMyoA相似的体外生化特性，但其主要在缓殖子阶段表达，表明它在包囊阶段可能执行特殊的功能。TgMyoD及其特异性相关轻链TgMLC2（TGME49_297470）定位于速殖子表膜。与TgMLC1类似，TgMLC2具有N端扩展，这对肌球蛋白MyoD的膜定位是必需的。然而，与TgMLC1不同的是，它没有与其他的蛋白如GAP蛋白相互作用，似乎是通过TgMLC2的直接棕榈酰化作用与细胞膜结合。TgMyoD的条件性敲除结果表明，它对体外速殖子的生长、滑动和对小鼠的毒力都不是必需的。TgMyoD敲除后，TgMLC2蛋白也会消失。弓形虫的MyoB和C定位于寄生虫的基底部，MyoB过表达会导致分裂余体增大。

TgUNC是弓形虫肌球蛋白的折叠、组装和发挥功能的分子伴侣。TgUNC的条件敲除会导致肌球蛋白功能的缺失，导致弓形虫分裂过程出现异常，说明肌球蛋白在弓形虫基底复合体收缩和同步分裂过程中具有重要作用（Weiss和Kim，2013）。

7.速殖子细胞周期中的细胞骨架动态变化

速殖子是弓形虫在体内大量增殖的阶段，因此精确了解其整个生命周期的生物学特性对预防弓形虫的急性感染至关重要。速殖子的整个增殖过程可分为5个阶段：黏附（attachment），入侵（invasion），纳虫泡形成（vacuole formation），增殖（replication）和逸出（egress）（图2-12）。整个过程涉及多种分泌器官的蛋白分泌，细胞骨架的变化以及钙离子信号途径参与的调控（Blader等，2015）。

（1）黏附：

弓形虫入侵宿主细胞是一个极其快速的过程，因此很难观察到其黏附的全过程。但现在可以确定的是，弓形虫的黏附和入侵是两个不相关的过程，因为通过药物如细胞松弛素D处理弓形虫速殖子，破坏其肌动蛋白，虽然可以阻断弓形虫的运动和入侵，但其仍然可以黏附在宿主细胞表面。弓形虫黏附在宿主细胞表面是其进行入侵的第一步，其中包括弓形虫表面蛋白与宿主细胞膜的结合，滑行运动（gliding motility）复合物的组装等过程。

首先，弓形虫在与宿主细胞接触后，通过由糖基磷脂酰肌醇（GPIs）锚定在其细胞膜表面的一类跨膜蛋白SAGs来识别宿主细胞膜，从而使弓形虫与宿主接触。例如，SAG1可以识别宿主细胞表面的硫酸蛋白聚糖（sulfate proteoglycan）从而使弓形虫黏附在其表面。在识别宿主细胞后，弓形虫会在宿主细胞表面迅速组装“运动复合物”来进行入侵。速殖子的运动对于虫体入侵新的细胞至关重要。尽管弓形虫能够滑动，弯曲，扭动和旋转，但是弓形虫速殖子并没有传统的运动结构如纤毛、鞭毛、伪足等，而是拥有一种特殊的运动方式称为滑行运动。滑行运动是顶复门寄生原虫以肌动蛋白为基础的在组织迁移和入侵宿主细胞过程中依赖黏附运动的一种方式。弓形虫速殖子有3种不同的滑行运动方式：①圆形滑动，弓形虫顺着其虫体拱起的方向逆时针转动；②垂直旋转，弓形虫后端黏附在底部并顺时针旋转；③螺旋旋转，弓形虫水平旋转向前运动。弓形虫只有进行螺旋旋转时才会进行长距离运动。

弓形虫黏附后的滑行运动需要首先在细胞表面形成滑行小体（glideosome）复合物。滑行小体复合物是弓形虫在细胞表面的黏附和滑行运动所需的一种分子复合物，在虫体细胞膜和内膜复合体之间形成并与宿主细胞的表面受体结合为弓形虫的滑行运动提供动力。弓形虫这种运动复合物由非典型肌球蛋白MyoA，轻链MLC1，MyoA必需的轻链ECL，滑行体相关蛋白GAP40（TGME49_301540）、GAP45（TGME49_278320）、GAP50（TGME49_314490）和GAP70（TGME49_233030）组成并定位于成熟弓形虫的表膜。MyoA是一种小的肌球蛋白，在弓形虫中也被认为是一个快速的分子马达。MyoA的头部区域可以将ATP水解释放的化学能转化为F-actin的定向运动从而推动弓形虫运动，MLC1会结合MyoA颈部区域的IQ序列，并作为一个杠杆将能量转化为动能。ELC是一种类似钙调蛋白的蛋白质，通过结合Ca2+直接介导马达蛋白的激活和运动。弓形虫敲除MyoA后尽管其生活周期受到严重影响，但仍能在细胞内增殖。一种可能的解释是，第二种定位于弓形虫基底端的肌球蛋白MyoC的存在带来了功能冗余并可能代替MyoA的功能。另一种肌球蛋白，MyoH最近被认为是MyoA和MyoC上游不可缺少的分子马达。MyoH位于弓形虫的顶端，在锥体向前突出的同时启动滑行运动。GAP40和GAP50是整合在IMC上的蛋白，稳定地将运动复合体锚定在IMC上，而GAP45和GAP70则通过它们N端的酰化位点锚定于弓形虫细胞膜上。GAP40是一种跨越IMC 9次的膜蛋白，分子量为37kD。GAP45预测包含一个N端卷曲螺旋结构域和一个C端球形结构域，其N和C端可以被酰化并通过丝氨酸磷酸化调控成熟滑行小体结构的定位和装配，而且GAP45的C端可以与MLC1的N端结构域相互作用。MLC1则通过保守的氨基酸延伸与MyoA结合从而将其定位到表膜，并通过GAP45将其锚定在IMC上，从而在表膜中形成一个GAP45-MLC1-MyoA的桥来确保在运动过程中膜的完整性，同时维持IMC与质膜之间的最适间距。敲除GAP45可导致MLC1被错误定位到细胞质中，破坏细胞膜与IMC的联系，使速殖子的运动、入侵和逸出能力明显降低。GAP70是一种与GAP45功能相似的蛋白，有一个保守的N端酰化位点、一个延伸的卷曲螺旋结构域和一个保守的C末端。相对于GAP45在后端表膜的定位，GAP70定位于顶部表膜的区域，通过N端酰基锚定在细胞膜上，而C端结构域则锚定在顶端。GAP70不是弓形虫必需的蛋白，敲除后速殖子没有明显的缺陷。GAP70的过表达可以部分补偿GAP45的缺失所造成的影响，推测GAP70可能具有促进IMC和质膜在顶端区域的解聚和内聚，从而允许锥体的扩张和收缩所需的更大的膜弹性。GAP50在氨基酸序列两端都有跨膜结构域，N末端的50个氨基酸是内质网靶向所必需的信号肽，在成熟和定位到IMC时被剪切，而C末端的跨膜螺旋将其固定在IMC中。最后IMC上的跨多层膜的滑行小体相关蛋白可以与GAP50和IMC膜泡结合从而连接运动复合物到IMC网络和膜下微管。

弓形虫的滑行运动需要信号分子、细胞骨架成分、分泌蛋白和菱形蛋白酶的协同作用。内膜复合体可以作为子代个体组装的支架以及滑行小体介导运动的支持结构，对弓形虫的运动、入侵和增殖至关重要。在形成滑行小体复合物后，滑行运动首先需要在弓形虫细胞膜和IMC外膜之间聚合形成肌动蛋白丝（F-actin），随后肌球蛋白MyoA和MyoH沿着聚合的F-actin轨道移动。滑行小体黏附在宿主细胞表面也需要与宿主细胞膜上的受体相互作用，以推动弓形虫向前运动，而行使此功能是黏附素（adhesin）。黏附素主要由微线体（microneme）分泌的蛋白组成，在弓形虫细胞表面与宿主受体结合。弓形虫的微线体至少分泌3种黏附素复合物，MIC6-MIC1-MIC4、MIC2-M2AP和MIC8-MIC3。MIC1结合宿主细胞表面的唾液酸，是入侵的主要决定因素。关于滑行小体和黏附素的连接前期的研究一直存在争论。在过去的数十年间，同型四聚糖酵解醛缩酶（aldolase，ALD，TGME49_269700）由于其F-actin结合活性，一直被认为具有行使这个关键的连接作用。的确，体外的实验证明，一些黏附素如的MIC2、TRAP和AMA1的胞质结构域均可以与ALD结合，同时，弓形虫ALD的缺失会导致其运动和入侵能力的缺陷。但是，在没有葡萄糖的实验条件下证明ALD与弓形虫滑行无关。随后，滑行小体相关连接蛋白（GAC）被发现可以结合F-actin以及MIC2的胞质结构域，起着连接滑行小体和黏附素的作用，在运动和入侵过程中沿着虫体移位。GAC定位于弓形虫速殖子的胞质、质膜下方和顶复体，其可以连接F-actin和MIC2黏附素，并通过PH结构域与磷脂酸（phosphatidic acid，PA）结合，在运动和入侵过程介导质膜表面黏附素与actin的连接，让锚定在内膜复合体的肌球蛋白MyoA在沿着F-actin移动的时候，将动力传递到质膜黏附素MICs，使MICs从顶复体分泌出来后，从顶复体沿着质膜向虫体后端移动，从而提供虫体沿着介质进行滑移运动。微线体分泌的黏附素如MIC2通过其短胞质尾部与GAC相互作用形成肌动蛋白-GAC-黏连蛋白复合物，在锥体部分，肌球蛋白MyoH直接通过其尾部结构域插入锥体并驱动锥体运动；而在锥体后端的IMC上滑行小体复合物开始组装，并通过MyoA的连续动作驱动弓形虫向后移位（Frenal等，2017）。IMC外膜骨架和相关的膜下微管对弓形的滑动同样至关重要，肌球蛋白马达复合物牢固地锚定在IMC外膜并在IMC和质膜的狭窄空间中起作用。

肌动蛋白聚合的调控是激活滑行运动的关键（Tosetti等，2019）。在弓形虫速殖子中，单体G-actin的浓度较高，而聚合的F-actin则不容易被检测到。目前的研究结果认为F-actin的聚合是瞬时过程，聚合的时空变化控制着运动的方向性和时间。肌动蛋白聚合的高度动态性在很大程度上是由其结合和水解ATP的能力来调节的。弓形虫内单体G-actin装载着ATP，以便容易地组装成F-actin丝。形成微丝后，ATP水解成ADP。弓形虫的微丝极不稳定，需要肌动蛋白结合蛋白的调节作用以保持微丝的稳定以及快速的聚集。弓形虫的肌动蛋白结合蛋白对ATP-actin和ADP-actin具有不同的偏好性，可以对核苷酸的转换和聚合起额外的调节作用。传统真核生物有多种蛋白质与G-actin结合，形成易于聚合的单体，这是快速形成肌动蛋白聚合物的先决条件，比如抑制蛋白（profilin）将G-actin隔离在预期聚合的位置，通过与脂质结合将其传递到聚合位点。然而，与哺乳动物的抑制蛋白促进F-actin组装不同，体外实验结果显示弓形虫的抑制蛋白TgPRF则是通过隔离G-actin来阻止F-actin的形成。环化酶相关蛋白（CAP）是另一种主要与G-actin结合的蛋白，在细胞内的速殖子中，CAP定位于顶端区域，而在细胞外的速殖子中，CAP则会快速地转换位置到胞质内。因此，当运动被激活时，CAP似乎被隔离在最初需要肌动蛋白聚合的顶端位置。从上述的结果来看，弓形虫的F-actin本质上是不稳定的，因此，弓形虫应该存在一些未知的微丝稳定蛋白调控微丝的装配和稳定性。

弓形虫的滑行运动过程中肌球蛋白和肌动蛋白聚合均需要ATP，然而关于这些能量的来源至今仍未清楚。先前的研究发现编码葡萄糖转运蛋白的基因被敲除后会影响弓形虫在缺乏谷氨酰胺的特定培养基中的持续滑动运动，但这种影响可以用弓形虫速殖子从谷氨酰胺分解和糖酵解中获得能量的能力来解释。此外，阿托伐醌（atovaquone）或氰化物处理对线粒体氧化磷酸化的破坏不会导致虫体滑行运动的缺陷，说明运动所需的能量不是来自氧化磷酸化。后续的研究发现，当弓形虫速殖子从宿主细胞逸出时，它们的糖酵解酶从分散的胞质位置转移到IMC上，这个过程在逸出后的几分钟内开始并在1小时后达到最大值，而且大多数定位于虫体外围。己糖激酶（HK），甘油醛-3-磷酸脱氢酶1（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 1，GAPDH1）、丙酮酸激酶1（pyruvate kinase 1，PK1）和乳酸脱氢酶1（lactate dehydrogenase 1，LDH1）均具有这种特性，但它们的转运和外周定位机制尚不清楚。关于这些糖酵解酶是否是为滑行运动提供能量，以及相关能量的运输过程仍需作更多的研究。

弓形虫在进入宿主细胞的过程中会逐渐脱落一些表面黏附素。黏附素的脱落有助速殖子重新定向，使其顶端朝向细胞内，这是入侵的必要步骤。弓形虫菱形蛋白家族中的菱形样蛋白酶4（TgROM4）会在跨膜位点裂解黏附素，可导致宿主受体-寄生虫配体相互作用的分离。TgROM4的敲除并不影响弓形虫的存活也不被其他菱形样蛋白酶补偿，但会导致未分离的黏附素和受体复合物向后方移位，并在速殖子的后端堆积，表现出原地旋转而不是向前的螺旋运动。未分离的黏附素在虫体的表面积累，可导致附着蛋白的增加和顶端重新定位的缺陷。

（2）虫体入侵和纳虫泡的形成：

弓形虫的入侵是一个快速的过程，通常在20秒左右完成并且不需要宿主细胞的参与，是一个主动侵入的过程。弓形虫的入侵除了需要激活滑行运动所需的肌球蛋白马达、肌动蛋白的聚合、和微线体的分泌外，还需要锥体的伸出和棒状体的分泌。

锥体突出（extrusion）是可逆的Ca2+介导的过程。蛋白激酶抑制剂会抑制锥体的突出，CDPKs可能在这个过程中起作用。锥体突出也需要肌动蛋白和肌球蛋白的作用（Long等，2017）。用细胞松弛素抑制F-actin的形成或抑制肌球蛋白都可以抑制锥体的突出，但抑制锥体的突出不影响微线体的分泌，而抑制微线体的分泌也不影响锥体的突出。所以锥体突出的过程是由Ca2+介导但与微线体的分泌互不影响，不过也需激活肌动肌球蛋白分子马达。

锥体突出后，细胞与伸展的锥体之间的紧密接触区域内凹，并在宿主细胞膜的凹陷处形成移动连接（moving junction）结构。移动连接结构是指宿主和弓形虫入侵界面的蛋白复合物，是微线体蛋白顶膜抗原1（apical membrane antigen 1，AMA1）和棒状体颈部蛋白（RON protein）之间的协同结构。弓形虫速殖子入侵过程中，在移动连接部位的宿主细胞中可以观察到F-actin、ARP2/3和表层蛋白的环状复合体。这种表层肌动蛋白细胞骨架的重建被认为对弓形虫锚定到宿主细胞并在入侵时启动宿主细胞膜的变形是极其重要的。弓形虫与宿主细胞膜建立移动连接结构后，弓形虫会通过这个结构向前移动并逐渐陷入宿主细胞膜内，移动连接结构也会随着虫体的入侵扩张并在虫体完全进入细胞后关闭。弓形虫入侵完成后，宿主的细胞膜会包裹着虫体，移动连接结构会在入侵的过程中筛选掉宿主细胞膜的跨膜蛋白以及脂筏蛋白，并且分泌一些蛋白来修饰包裹虫体的细胞膜最终形成纳虫泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）。弓形虫入侵过程完成后，宿主细胞的线粒体和内质网会被招募至纳虫泡周围，维持其在胞内的发育。

（3）增殖：

弓形虫在无性繁殖阶段会出现两种增殖模式，即在速殖子繁殖时常见的孢内芽殖（endodyogeny），和在裂体生殖阶段出现的孢内多芽增殖。孢内芽殖每次只进行一次核分裂形成两个子代细胞，而孢内多芽增殖中，细胞核则会多次分裂形成一个多核母细胞后再组装子代细胞。两种增殖方式在有丝分裂过程中均会保持完整的核膜并且染色体不压缩，这就意味着染色体的复制和分裂是在核膜内完成，并且都是在母体细胞内组装子代的胞器并形成完整的虫体。

弓形虫细胞起始复制的第一个标志发生在G1期的高尔基体的扩大和复制以及顶质体的分裂，随后在S期早期中心体复制为2个。在S期，子代细胞开始进行出芽，细胞骨架成分开始在顶端组装到新复制的中心体，两个子代细胞的内膜复合体的前端、膜下微管和锥体在顶端形成呈穹顶状结构，弓形虫的细胞核变成马蹄形，细胞核的末端移动到发育中子代的穹顶状结构前端。内膜复合体和膜下微管从顶端继续向后延伸，包裹一半的高尔基体，顶质体和细胞核，最终将细胞核挤压成两个，随后包裹的是内质网，最后是分裂的线粒体。弓形虫的分泌胞器是重新合成的，需要一个囊泡特异的动力相关蛋白DrpB，运输从高尔基体产生的囊泡合成顶端的棒状体和微线体。子代在母细胞内继续生长直到细胞骨架组装完成，然后母体细胞的内膜复合物消失，其外层细胞膜成为子代细胞的细胞膜。

弓形虫在核分裂的过程中，为了要保持核膜完成以及染色体在不压缩的情况下正确分离，纺锤体的两极（spindle poles）会以一种特殊的方式插入到核膜内，形成一个电子致密的膜内陷结构，称为中心锥体（centrocone）。纺锤体的复制发生在核膜内，然后可能通过纺锤体之间产生的微管向外迁移，在核膜内形成一个加宽的中心锥体隧道（centrocone-tunnel）结构，在跨越核膜的中心锥体隧道结构牵引下，微管穿过核膜延伸并汇集于细胞质一侧与中心体相连。在整个细胞周期的过程中，纺锤体微管和相关结构会锚定染色体着丝粒上的着丝点（kinetochore）在核膜上的中心锥体区域，以保证染色体分离。

1）弓形虫中心体：

典型哺乳动物细胞内中心粒是9+2的三联管结构，成对存在，在复制后垂直排列。中心体是由包含g-微管蛋白、中心体蛋白和中心粒周物质（pericentriolar material，PCM）包围的中心粒对组成。纺锤体微管通过着丝点与染色体的着丝粒连接，并在有丝分裂过程分离染色体。典型的中心体具有四个基本性质：①成核/锚定/组织微管的能力；②每个细胞周期复制一次；③与细胞核的物理联系（并非在所有生物体中存在）；④无膜包裹。然而弓形虫的中心粒（直径150nm）是一个非典型的结构，由一条中心小管和9条单个短管（长100nm）组成的9+1单微管结构，而虫体的中心体则由两个平行的中心粒组成，缺少中心体周围基质。中心体位于细胞质中与中心锥体内的纺锤体紧密相连，包含两个功能区域：组织有丝分裂的近端区域以及与起始胞质分裂有关的远端区域。在G1/S期分界点，细胞核底部的中心体复制，然后在S期迁移到核的顶端，S期DNA开始复制，并在复制到大约1.8倍DNA含量时暂停，纺锤体和纺锤丝开始装配，随后纺锤体移到细胞顶部开始进行有丝分裂，第一个子代细胞骨架开始在已经复制的中心体上积累。中心体在有丝分裂和胞质分裂中的功能分离，从而使有丝分裂周期与细胞分裂周期分开。

弓形虫的中心体的分裂可能由基因组中存在的多种激酶，如Arks（aurora相关激酶）、NIMA相关激酶、CDPK7（钙依赖蛋白激酶7）和MAPK-L1（丝裂原活化蛋白激酶样）协调进行。弓形虫Ark1存在于细胞核中，是有丝分裂所必需的酶，Ark2与有丝分裂纺锤体相关，Ark3与中心体外核和子代细胞骨架有关，是内出芽增殖和复制所必需。NIMA相关激酶NeK1调控中心体的复制，NeK1的突变会导致中心体的复制停滞并阻断细胞分裂。MAPK样的非典型激酶（MAPK-L1）和精氨酸甲基转移酶1（PRMT1）定位于中心体周围基质，功能分析显示，正常的子细胞出芽和有丝分裂需要MAPK-L1，而PRMT1则参与出芽过程和中心体组分的维持，最后，CDPK7参与中心体的定位和完整性。

2）子代细胞分裂中细胞骨架蛋白的变化：

子代细胞形成的过程中细胞骨架会进行一系列有序的变化。许多细胞骨架成分如GAP40、GAP50、微管、SPM1、TgSPM2和IMC1、3～6、8～11、13和15是在发育中的子代细胞中出现并发挥作用的，而一些细胞骨架蛋白如MyoA、MLC1、GAP45、GAP70、MSC1b、RNG1和TGME49_201950/RNG2直到子代个体在形成成熟的表膜时才开始出现。在子代个体的发育过程中，首先是IMC15定位在新复制的中心粒上和ALP1在新生子代细胞上的定位，接着MORN1首先定位在中心锥体，随后定位在决定了早期IMC的顶端和后端环中。随着两个子代IMC的伸长，各自包围着变为马蹄形的核的一半，膜下微管和相关蛋白（SPM1和SPM2）以及IMC1、3～6、8～11、13和15沿着生长的子代IMC结构延伸。一旦子代细胞成熟，母体的顶端复合体被分解，子代个体从母代体内萌发，母体的IMC和顶端胞器的残余物沉积在新生个体后部的结构中，称为分裂余体。弓形虫发育完成时，两个子代弓形虫被新生的IMC与顶极环、膜下微管和IMC相关蛋白细胞骨架包围，每个子代个体都会包含一套完整的顶复器以及一个线粒体、高尔基体、顶质体和细胞核。根据子代发育的程度可以将弓形虫的整个发育阶段分为出芽起始、出芽早期、出芽中期和出芽后期4个阶段（Francia和Striepen，2014）。

①出芽起始：弓形虫分裂起始时，中心体最先复制并引导子代细胞的装配，而中心体的动态变化可以由三种已鉴定的中心体蛋白TgCentrin1、2、3来监测。中心体复制时，IMC15和Rab11B共定位在中心体的顶端，标志着子代细胞骨架装配的开始。IMC15是从复制的中心体聚集到新形成的IMC上最早的蛋白，而Rab11B的作用是将囊泡转移到IMC上形成外层的膜，保证IMC的蛋白与膜组分的同时装配。除了Rab11B，肌动蛋白样蛋白ALP1也参与IMC膜的产生，在出芽时ALP1先于IMC家族的其他成员出现，表明其在早期的子代形成过程中起作用。MORN1蛋白的出现则标志着出芽起始阶段的结束。膜下微管结构同样在起始阶段形成，在中心体复制后不久，膜下微管和锥体开始装配。微管结合蛋白、2个锥体内微管和TgICMAP1也同时出现。IMC和膜下微管纤维一起构成子芽形成的基础。

②出芽早期：MORN1蛋白被招募后，ISP1-3蛋白开始出现。在DNA复制到1.8N左右时，IMC3和IMC1随ISP蛋白进入子代细胞。目前的研究结果认为，在子代发育过程中其他的如IMC蛋白IMC4、6和10出现在子代细胞的时间与IMC1和3相同。在出芽早期阶段，滑行小体的组成部分GAP50和GAP40也开始出现。随着所有早期组件的就位，形成的子代细胞骨架开始生长。微管装配的过程可能为IMC延伸提供动力，但IMC纤维在一定程度上也能自主组装。由MORN1蛋白构成的环的出现标志着早期细胞骨架的生长已经到达后端。不过，MORN1同时也定位在早期锥体，主要出现在子代细胞的顶端。一旦延伸的细胞骨架到达顶帽（apical cap）的边缘，TgCentrin2蛋白会出现并标记在顶帽的周边。当细胞骨架通过顶帽区继续生长时，ISP1会滞留在该区内。

③出芽中期：出芽中期，子代细胞骨架开始通过顶帽区向基底处延伸。在中心体复制大约1.5小时后，PhIL1出现在顶帽区，而TgCAM1、TgCAM2和TgDLC则出现并定位在锥体的膜下微管区域，后端的IMC蛋白会重新定位，IMC5、8、9和13从子代细胞的边缘定位到MORN1所在的生长基底末端。Ca2+依赖的微丝和收缩蛋白TgCentrin2被认为是驱动基底复合体收缩的蛋白，TgCentrin2在IMC5、8、9、13向基底复合体移位的同时开始在基底复合体上组装。在基底复合体开始收缩后不久，热休克蛋白20（Hsp20）出现并定位在IMC的外膜。基于疟原虫的研究结果表明，Hsp20对细胞分裂不是必需的，但其控制子孢子不同的滑动运动模式。

④出芽后期：弓形虫出芽后期，子代细胞的细胞骨架成熟，母体的细胞骨架开始被解聚。母体细胞骨架开始分解之前，RNG1出现并定位于顶极环，标志着这个阶段的开始。子代细胞包裹整套细胞器后，需要一系列协调过程来替代母体的IMC形成子代的IMC、分离子代细胞的细胞膜以及将子代细胞的后部与母体细胞的残余部分分离等。子代虫体内膜复合体的膜组分由来自内质网-高尔基体系统的扁平囊泡拼凑而成，IMC蛋白的转运则是通过内质网-高尔基体-内体样泡（ELC）途径转运的，小GTP酶Rab11a和Rab11b介导其囊泡的转运过程，融合蛋白6（syntaxin 6，Stx6）则介导从ECL到高尔基体的逆向转运并与维持高尔基体的组织有关。实验结果表明，位点失活的Rab11a和Rab11b由于破坏了IMC的装配，因此扰乱囊泡运输、细胞器分离和胞质分裂。在出芽的后期，Rab11b对IMC的形成是必需的，而过表达缺陷的Rab11b蛋白会导致子代细胞的IMC的紊乱，导致子代虫体不能存活。肌动蛋白样蛋白ALP1同样涉及IMC的装配，起着与Rab11b类似的功能。MORN1对弓形虫IMC的形成同样重要，细胞分裂过程中它被迅速招募到新形成的IMC上，可能参与IMC与微管的相互作用。条件性敲除MORN1可导致基底复合物装配缺陷，导致弓形虫形态残缺。而过表达Stx6则会破坏子细胞组装后期蛋白向IMC的囊泡运输。出芽分裂最后出现的是TgMSC1a，它是成熟基底复合体的特异性标记蛋白。

滑行小体也是在出芽后期开始在细胞膜和MIC之间装配，GAP45与MLC和MyoA一起被招募到GAP50上。除了顶帽区外，GAP45将细胞膜锚定在IMC外膜上。在顶帽处，GAP70将质膜和IMC之间连接。在成熟的基底复合物形成后，其后端仍与母体细胞的残余物结合，直至成熟的基体复合体收缩，子代细胞后端使其与残余物分离才完成胞质分裂。此时，MORN1、Cen2、MyoB/C、肌动蛋白、去酪氨酸化的微管蛋白和DLC1均定位于新生子细胞的后端，在核分裂完成后IMC5、IMC8、IMC9和IMC13也从IMC移至基底复合体。最后，母体细胞骨架解聚从顶端开始，而其细胞膜则通过Rab11a的作用被整合到子代细胞膜中，通过成熟的基底复合物收缩将成熟的子代与母体细胞分离。

3）虫体的细胞周期调控：

在哺乳动物细胞中，细胞周期及其各检测点是由蛋白磷酸化和蛋白降解的调控网络控制的，其中最重要的组成部分是细胞周期蛋白依赖性激酶（cyclindependent kinase，CDK）及其调节因子细胞周期蛋白（cyclin）。在弓形虫中存在一些细胞周期蛋白、激酶和细胞周期特异性转录因子，如许多同源的CDKs和A-B家族细胞周期蛋白，可以在细胞周期突变的酵母中恢复其细胞周期。弓形虫的细胞周期转录主要在两个阶段大量表达，其中G1期大量转录增殖管家基因，而进入S期，则转录编码组装子代细胞和入侵宿主细胞所需的蛋白。这些基因表达被认为是由一系列的Apetala2（AP2）转录因子所驱动的。ApiAp2s已被证明可以与多个调控基因的启动子元件结合，对这些基因的转录起到促进和抑制作用。除了转录因子外，其他因子如弓形虫的RNA识别位点1（TgRrm1）也被证明在细胞周期过程中起关键作用。

（4）逸出：

弓形虫从胞内逸出存在两种情况，受到足够的宿主免疫压力或在宿主细胞发育成熟后的逸出（Caldas和de Souza，2018）。弓形虫入侵宿主后，宿主强烈的免疫反应会引起弓形虫的逸出，主要的途径是由穿孔素和死亡受体（Fas/FasL）介导的宿主细胞的损伤并导致胞内的钾离子浓度下降从而引起的逸出。当宿主没有足够免疫压力的时候，弓形虫会在宿主细胞内发育成熟并逸出，包括几种不同的途径。首先是弓形虫在宿主细胞复制的过程中顶质体会不断产生脱落酸（abscisic acid，ABA）。当脱落酸上升到一定的浓度时，弓形虫会逸出。另外，弓形虫的复制也会导致纳虫泡内pH的酸化，低pH的环境会导致胞内钾离子浓度下降从而抑制微线体的分泌进而引起弓形虫逸出。关于脱落酸以及酸化如何导致弓形虫逸出的具体机制尚不清楚，仍待后续研究。另一种诱导逸出的途径涉及弓形虫分泌到纳虫泡内的三磷酸核酸酶（triphosphate nuclease，NTPases），这种酶会降解宿主细胞的ATP导致钠钾ATP酶泵（Na+/K+-ATPase pumps）活性下降，从而造成胞内钾离子浓度下降，诱导胞内储藏的Ca2+释放，最终导致弓形虫逸出。

弓形虫逸出的过程是由微线体穿孔样蛋白TgPLP1和宿主钙蛋白酶1（calpain1）辅助的。TgPLP1可以在纳虫泡膜和宿主细胞膜上穿孔，calpain1是一种半胱氨酸蛋白酶，可以重塑宿主细胞骨架。同时速殖子的运动也会施加一种机械力，确保纳虫泡膜和宿主细胞膜的破裂。

总结速殖子的整个生命过程，可分为5个阶段：黏附（attachment），入侵（invasion），纳虫泡的形成（vacuole formation），增殖（replication）和逸出（egress）。

1）速殖子起始黏附：首先通过表面的SAG蛋白识别宿主，随后分泌黏附素（MIC蛋白）与宿主细胞受体结合，同时弓形虫在细胞表面组装形成滑动体（glideosome），该滑动体由非典型肌球蛋白MyoA、轻链MLC1、MyoA必要轻链ECL、滑行体相关蛋白GAP40、GAP45、GAP50和GAP70组成。其通过肌动蛋白（actin）和滑动体相关连接蛋白（GAC）相互作用，并连接黏附素。而IMC上跨膜的滑动体相关蛋白（GAPM）则连接滑动体到弓形虫IMC网络和膜下微管。

2）在形成滑动体后，弓形虫细胞膜和IMC外膜之间会聚合形成F-actin，在锥体部分肌球蛋白为MyoH末端直接插入锥体，前端则通过GAC与黏附素连接，锥体后端的IMC上则由滑动体和GAC连接MyoA、IMC、F-actin和黏附素，随后肌球蛋白MyoA和MyoH沿着聚合的F-actin轨道移动推动弓形虫运动。

3）弓形虫入侵过程中，锥体伸出，细胞与伸展的锥体之间的紧密接触区域内凹，形成移动连接（moving junction）结构。移动连接结构是微线体蛋白顶膜抗原1（AMA1）和棒状体颈部蛋白（RON protein）之间的协同结构。弓形虫会通过这个结构向前移动并逐渐陷入宿主细胞膜内，移动连接结构也会随着虫体的入侵扩张并在虫体完全进入细胞后关闭，其在弓形虫入侵的过程中会筛选掉宿主细胞膜的跨膜蛋白以及脂筏蛋白，同时弓形虫会分泌棒状体蛋白（ROP）和致密颗粒蛋白（GRA）来修饰包裹虫体的细胞膜，最终形成纳虫泡膜（PVM）。

4）弓形虫速殖子在环境适宜时进行孢内芽殖（endodyogeny），此时中心体复制为2个，弓形虫的细胞核变成马蹄形，细胞骨架成分开始在顶端组装到最近复制的中心体，两个子代细胞的内膜复合体的前端、膜下微管和锥体在顶端形成并呈穹顶状结构，细胞核的末端移动到发育中的子代的穹顶状结构前端，向后延伸最终在一个母代细胞内形成两个子代细胞。

5）当速殖子受到足够的宿主免疫压力或在宿主细胞发育成熟后会在纳虫泡膜和宿主细胞膜上穿孔从而破裂细胞逸出再次感染新的细胞。

综上所述，基于目前对弓形虫的认识，人们一般认为速殖子入侵宿主细胞首先是通过其表面的SAG蛋白识别宿主，随后分泌黏附素（MIC蛋白）与宿主细胞受体结合，同时弓形虫在细胞表面组装形成滑动体。该滑动体由非典型肌球蛋白MyoA、轻链MLC1、MyoA必要轻链ECL和滑行体相关蛋白GAP40、GAP45、GAP50和GAP70组成。滑行体复合物通过肌动蛋白丝（F-actin）和GAC相互作用从而连接到黏附素。在IMC上的跨膜滑行体相关蛋白（GAPM）则连接滑动体到弓形虫IMC网络和膜下微管。随后，肌球蛋白MyoA和MyoH沿着聚合的F-actin轨道移动，推动弓形虫运动。在弓形虫的入侵过程中，其锥体伸出，引起细胞与伸出锥体之间紧密接触的区域内凹，形成移动连接（moving junction）结构。如前所述，移动连接结构是微线体蛋白顶膜抗原1（AMA1）和棒状体颈部蛋白之间的协同结构。弓形虫会通过这个结构向前移动并逐渐陷入宿主细胞膜内。动态连接结构也会随着虫体的不断入侵而扩张，并在虫体完全进入细胞后关闭。在入侵的同时弓形虫会分泌棒状体蛋白（ROP）和致密颗粒蛋白（dense granule protein，GRA）来修饰包裹虫体的细胞膜最终形成纳虫泡膜（PVM）。弓形虫速殖子在环境适宜的时候会进行孢内芽殖。此时，中心体复制为2个，细胞核变成马蹄形，细胞骨架成分开始在顶端组装到新复制的中心体，两个子代细胞的内膜复合体的前端、膜下微管和锥体在顶端形成呈穹顶状结构，细胞核的末端移动到发育中的子代的穹顶状结构前端，向后延伸，最终在一个母代细胞内形成两个子代细胞。如果条件许可，此过程可以不断重复。当速殖子受到足够的宿主免疫压力或在宿主细胞发育成熟后会在纳虫泡膜和宿主细胞膜上穿孔从而破裂细胞逸出再次感染新的细胞。

二、纳虫泡和纳虫泡膜

1.纳虫泡结构

纳虫泡（parasitophorous vacuole，PV）是弓形虫在入侵宿主细胞后外部包裹虫体的一个泡状结构，其外层膜称为纳虫泡膜（parasitophorous vacuole membrane，PVM）。纳虫泡膜是宿主细胞的膜结构和弓形虫分泌蛋白修饰而成。PVM具有孔隙结构，允许高达1 300道尔顿（Dalton）的带电分子在纳虫泡和宿主细胞质之间进出。早期形成的PVM内表面光滑，长100nm，宽60nm的微细结构均匀分散在PVM内表面，膜上有一些大小和分布不规则的开口，最小的开口是孔状圆形的，直径小于10nm，但是也存在宽100～200nm的其他开口。新形成的纳虫泡会有许多突起物，小孔不但数量非常少而且直径也很小（10nm或更小）。随着发育的不断进行，开口逐渐增大变多，突起物逐渐减少。这些开口所起的作用仍然未知，而PVM的外表面也发现可以与宿主细胞质的物质接触相连，推测这些开口可能是营养物质从宿主细胞进入纳虫泡的通道。

纳虫泡内并不是一个空泡，在弓形虫入侵宿主细胞后，会在纳虫泡内分泌物质并在纳虫泡内形成复杂的结构，至今至少发现有4种不同的结构，包括纳虫泡内泡网络（intravacuolar network，IVN）、连接泡内空间的连接小管、囊状的封闭膜结构以及分裂余体（Clough和Frickel，2017）（图2-13）。IVN是纳虫泡内复杂的膜状小管网状结构，其小管具有相对统一的大小和直径，平均直径为30～35nm，每单位膜的厚度平均约8nm。纳虫泡内虫体与纳虫泡膜之间，每个虫体之间以及虫与分裂余体之间均会形成IVN，这些小管连接每个虫体并使虫体后端与分裂余体相连，并且有一些分支以加强连接作用。IVN是由直径5nm和长度超过100nm的F-actin丝在直径50～60nm的纳米管中组装而成，这些F-actin丝被证明可以调节IVN的结构、分裂余体的形成、纳虫泡内弓形虫的排列以及虫体之间囊泡的运输。IVN的功能主要是使虫体在纳虫泡内保持紧密的状态以节省空间，它能组织虫体在纳虫泡的位置，形成花瓣状的结构。通常纳虫泡体积增大8倍，其内的虫量会扩大32倍。IVN使弓形虫充分利用纳虫泡内的空间以利增殖，每个新的子代个体都会形成新的IVN小管以彼此连接，直至弓形虫破裂逸出侵染新的细胞。泡内的连接小管是由大量的丝状物构成，这些丝状物不均匀，单个丝状物的厚度从2nm到10nm不等，它们将IVN小管、速殖子和纳虫泡膜的内表面相互连接。

2.纳虫泡膜的蛋白修饰

致密颗粒蛋白对于纳虫泡膜以及纳虫泡内物质的形成至关重要。至今已经鉴定多种致密颗粒蛋白与纳虫泡相关。例如GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA14、和GRA15均定位在纳虫泡膜。GRA3是Ⅰ型PVM相关的跨膜蛋白，GRA7与ROP2和ROP4结合，并与ROP18蛋白复合物协同作用抵抗干扰素激活的宿主免疫。GRA8在PVM中的作用目前尚不清楚，但最近发现该蛋白在组织膜下细胞骨架和运动中发挥着作用。GRA14定位于PVM的延伸部位（PV extension，PVE），可以通过PVE在不同的纳虫泡内交换。GRA15会激活宿主细胞的NF-κB途径从而激活下游免疫通路。GRA2、GRA4、GRA6、GRA9和GRA12则与IVN膜相关。GRA2和GRA6是构建具有膜状特征的PV的IVN纳米小管的关键分子。敲除GRA6的弓形虫，其IVN形态由原先的膜状纳米小管变成不相连的小泡。GRA2定位于泡内网络IVN上，敲除GRA2会导致泡内小管网络IVN组装失败以及在虫体后端内陷处形成突出的多片状小泡簇。体外实验证明，GRA2和GRA6可以通过结合脂质在体外将大的单囊泡重塑为纳米管膜。敲除GRA12会影响弓形虫对宿主免疫作用的抵抗能力。GRA2、GRA3、GRA4和GRA12的缺失均会影响弓形虫对小鼠的致病力，并且影响其在小鼠体内包囊的形成。

弓形虫PVM上也存在许多棒状体蛋白的修饰，包括棒状体蛋白ROP2、ROP3、ROP4和ROP7。最近的研究也发现了一类特殊的棒状体蛋白激酶家族包括ROP33、ROP34和ROP35，它们缺少在典型激酶中核苷酸结合所需的富含甘氨酸的位点，命名为With-No-Gly-loop（WNG）（Beraki等，2019）。弓形虫会将这些保守的激酶分泌到纳虫泡中。研究结果显示，该类激酶中至少有一个家族成员，WNG1/ROP35具有磷酸化的活性。一些与IVN膜和PVM相关的蛋白是依赖WNG1进行磷酸化的，例如参与IVN形成的GRA2和GRA6。这些磷酸化位点的缺失导致纳虫泡超微结构异常，比如驱动IVN小管组装的膜结合蛋白质的丢失，说明WNG激酶家族蛋白调节IVN的组装和维持，对纳虫泡的稳定至关重要。

3.纳虫泡的功能

弓形虫的PVM是一个非融合的膜结构，不参与内吞、外排等膜转运过程，并且不与溶酶体融合。弓形虫需要许多外源的营养来维持其正常的生长，包括色氨酸、胆固醇和铁等，所以PVM一个重要的功能就是作为营养交换的通道。研究发现，定位于PVM的GRA17和GRA23对于营养物质和小分子在PVM中的双向扩散至关重要。弓形虫内的一些分泌蛋白同样需要穿过PVM进入宿主细胞，如GRA16和GRA24可以进入宿主细胞核影响宿主的基因转录过程。纳虫泡也会摄取宿主膜以提供寄生虫所需要的脂质，这些宿主脂质被动态地整合到IVN膜中。由于弓形虫这些蛋白修饰使纳虫泡内产生一个稳定适宜的环境利于弓形虫的增殖。

PVM形成之后会招募宿主细胞内的线粒体、微管组织中心和内质网与其相接，这种膜与器官相接结构是非常稳定的。宿主细胞的中间丝和微管会在PVM周围重新排序，可能参与使纳虫泡接近宿主细胞核的过程。同时宿主细胞的微管组织中心也从核膜定位于PVM，溶酶体也迁移至虫体周围，其功能可能是促进弓形虫对胆固醇的吸收。早期的研究结果认为，弓形虫对宿主线粒体的招募是由棒状体蛋白ROP2引起的，但是敲除ROP2并不影响弓形虫对宿主线粒体的招募。由于线粒体的招募现象只在Ⅰ型和Ⅲ型株的弓形虫中发现，人们通过与不能招募线粒体的Ⅱ型株进行比较后发现，Ⅱ型虫株不能招募线粒体的原因是由于缺失了MAF1b蛋白（Kelly等，2017），而弓形虫Ⅰ型和Ⅲ型株中存在MAF1蛋白并可以进入宿主线粒体参与线粒体的招募。此外，敲除ASP5蛋白导致的MAF1错误定位也显著减少线粒体的招募。这些结果有力地证明，MAF1对宿主线粒体招募的功能。线粒体的功能可能是给弓形虫提供其合成不足的硫辛酸。

三、分泌器官：棒状体、微线体和致密颗粒

如前所述，弓形虫共有3个分泌器官，即位于细胞顶部的微线体（microneme）和棒状体（rhoptry）以及分布于胞质中的致密颗粒（dense granule）。这些胞器在弓形虫生活史过程中会分泌大量的蛋白。根据分泌胞器的不同分别将它们命名为微线体蛋白（MIC）、棒状体蛋白（ROP）以及致密颗粒蛋白（GRA）。棒状体蛋白又分为定位于茎部的棒状体蛋白（ROP）和定位颈部的棒状体颈部蛋白（RON）。这些分泌蛋白对于弓形虫的黏附、入侵、纳虫泡的形成和成熟以及增殖和存活至关重要。

（一）微线体

微线体大小250nm×50nm，呈杆状，速殖子中有50～100个微线体，位于弓形虫锥体之后的顶部区域（图2-10）。微线体在亚群和成熟程度方面表现出多样性，超分辨显微镜观察到弓形虫内存在两个微线体亚群，位于顶端（集中在锥体下方）的微线体和边缘/外侧（外围和沿虫体下方）的微线体。这两个亚群呈现出不同的运输方式、独特的定位和蛋白质组成。首先是一种称作融膜蛋白（parafusin）的蛋白质的定位差别，这种蛋白只与顶端的微线体共定位；其次敲除核内体分选复合物（endosomal tethering complexes，CORVET/HOPS complexes）的特定组分只会导致位于边缘的微线体内容物的丢失。这些差别说明微线体两个亚群可能分泌不同的蛋白从而行使不同的功能。

微线体蛋白（microneme protein，MIC）

微线体会分泌一大类蛋白，它们参与弓形虫的逸出、黏附、运动、棒状体分泌和宿主细胞入侵等重要生理功能。至今已鉴定出弓形虫分泌的众多微线体蛋白。在基因组测序时代之前，利用单克隆抗体鉴定出了MIC1、MIC2和MIC3。随着基因组测序技术的发展，根据弓形虫基因组进行同源比对和分析，越来越多的MICs以及MICs相关蛋白被鉴定出来（表2-1）。

（1）黏附素：

黏附素是一类特殊的、占主导地位的、由微线体蛋白组成的复合物。这些蛋白可以根据其黏附结构域进行分类，而黏附结构域可与多种宿主细胞表面抗原包括蛋白质和碳水化合物，如胶原蛋白和唾液酸结合。黏附素的主要作用是参与弓形虫对宿主细胞的附着、运动和入侵。

黏附素复合物在分泌过程的早期组装，可协调某些可溶性亚基的正确定位。黏附素复合物分布在虫体表面并通过蛋白的跨膜域锚定在弓形虫的细胞膜，这些蛋白的C末端与滑行小体复合物相互作用并逐步被转移到虫体的后部。这种复合物向后的移动产生了向前的运动，对虫体的滑动、转移和入侵至关重要。这些复合物有两个功能，一是它们对一些分泌蛋白的正常运输很重要，二是它们可以协同结合，以增强细胞识别和弓形虫入侵细胞的能力。目前在弓形虫中已鉴定出3种黏附素复合物，它们分别是MIC1、MIC4和MIC6。可溶性的MIC1和MIC4的正确定位需要与膜结合蛋白MIC6相互作用，例如MIC1的半乳糖凝集素位点与MIC6结合通过适当的折叠确保复合物定位到微线体。MIC1的敲除会导致MIC4和6在微线体的靶向缺陷，使弓形虫入侵能力降低。弓形虫敲除MIC6则会引起MIC1和MIC4的错误定位，并导致入侵细胞能力降低大约50%。其次是MIC2/M2AP黏附素复合物。可溶性蛋白M2AP可以与MIC2形成稳定的复合物并确保其正确定位到微线体。缺失M2AP时，MIC2不能有效地靶向微线体，最终会被降解，导致弓形虫入侵细胞能力下降。已有的研究表明，MIC2的多聚化可以增加与宿主细胞受体的相互作用，从而形成一种多价黏附蛋白。条件性敲除MIC2会影响弓形虫的滑行运动和黏附，导致入侵能力下降以及失去感染小鼠的能力。MIC2可以结合宿主细胞的ICAM-1，促进弓形虫在上皮细胞的迁移。最后一个是MIC3/MIC8复合物。与其他已证实的MIC复合物不同，MIC3和MIC8对微线体的靶向并不相互依赖，任何一种蛋白的敲除都不会改变另一种蛋白的定位。MIC8与弓形虫棒状体的分泌相关。条件性敲除弓形虫的MIC8，尽管没有影响其滑动和顶端黏附能力，但可导致弓形虫棒状体分泌受阻从而影响其对细胞的入侵。MIC3和MIC8在弓形虫入侵时形成的复合物组装在移动连接（moving junction）结构上可促进棒状体的分泌。

（2）穿孔素样蛋白1（perforin-like protein 1，PLP1）：

PLP1也是由微线体分泌，其作用是在弓形虫逸出时裂解纳虫泡膜。敲除PLP1不但会导致弓形虫逸出细胞的延迟和造成一部分弓形虫不能逸出细胞，而且严重降低其对小鼠的感染力。同样的，微线体分泌的另一种类穿孔蛋白的作用也是破坏纳虫泡和宿主细胞膜的完整性，从而使弓形虫得以顺利逸出。类穿孔蛋白是微线体中独特的孔隙形成蛋白，在顶复门原虫的微线体和微线体样细胞器中具有保守性。这些蛋白分泌后形成复合物来行使它们的功能。

（3）其他微线体蛋白：

AMA1是一种整合的膜蛋白，在虫体黏附宿主细胞时先与RON2相互作用，最终形成包含RON2、RON4、RON5和RON8的移动连接结构，帮助弓形虫进入宿主细胞。条件性敲除弓形虫AMA1的研究结果表明，AMA1不参与虫体的滑动运动以及黏附的初始阶段，也不参与微线体的分泌，但敲除AMA1后由于弓形虫不能与宿主细胞紧密结合，可导致入侵能力下降。MIC3、MIC6、MIC8和SPATR在速殖子和缓殖子中均有表达，而MIC7和MIC9主要在缓殖子阶段表达，它们的功能可能与MIC6和MIC8的功能相似，即作为其他MIC蛋白的分子伴侣。SPATR是一种可溶性蛋白，经微线体分泌并定位于细胞外速殖子的表面，SPATR的敲除会导致弓形虫入侵能力缺陷和降低对小鼠的感染力。MIC10是在入侵过程中分泌的，速殖子中的表达量高于缓殖子。与其他MICs不同的是，MIC10在分泌后既不与弓形虫细胞膜结合，也不与宿主细胞结合，其作用仍待确定。MIC13/MCP2在弓形虫的各个时期均有表达，但在缓殖子和子孢子中的表达量更高。与MIC1类似，MIC13可以与唾液酸低聚糖结合，可能也起着黏附作用。

某些蛋白酶也是微线体分泌蛋白。微线体中至少发现了3种蛋白酶SUB1、ROM1和TLN4。SUB1是一种枯草杆菌蛋白酶类型的丝氨酸蛋白酶。SUB1在弓形虫速殖子入侵过程中对虫体表面的其他MIC蛋白进行修饰，调节它们的黏附活性。SUB1的活性则是由MIC5来调节的。MIC5可以通过其C端肽来抑制SUB1的活性，以阻止SUB1对特定底物的过度处理或对其他表面或分泌蛋白的不当处理。MIC5的敲除会导致表面MICs的水解。ROM1属于菱形的丝氨酸蛋白酶家族，条件性敲除ROM1可导致弓形虫的入侵和细胞内增殖能力的降低。TLN4是一种胰岛素酶家族的金属蛋白酶。尽管ROM1和TLN4的底物未知，但这些蛋白酶可能在细胞器分泌前后的MICs处理过程中发挥作用。

（二）棒状体

弓形虫的棒状体是呈长棒状的细胞器，有8～10个，位于虫体的前部，从锥体向细胞核方向延伸。棒状体有一个长2.5μm的狭窄的棒状体颈部（rhoptry neck）和一个位于后端的大小0.25μm×1μm的囊泡状的棒状体球茎部（rhoptry bulb）。棒状体在弓形虫入侵早期分泌大量参与入侵、纳虫泡的修饰以及影响宿主基因表达的相关蛋白，以保证弓形虫入侵和存活。根据分泌蛋白在棒状体的定位，棒状体分泌的棒状体蛋白（rhoptry protein，ROP）和棒状体颈部蛋白（rhoptry neck protein，RON）大部分具有激酶活性，又称作棒状体激酶或假激酶（表2-1）。

1.ROP2家族/棒状体激酶（ROPK）

这些蛋白具有一些共同的特征，即存在C末端的蛋白激酶位点以及一个小的氨基酸丰富的N末端区域。目前已经鉴定出21个ROPK，其中19个在棒状体，包括ROP2、ROP4、ROP5、ROP6、ROP8、ROP11、ROP16、ROP17、ROP18、ROP19、ROP20、ROP23、ROP24、ROP25、ROP26、ROP31、ROP38、ROP39和ROP40；两个（即ROP21和22）定位在顶端但不与棒状体共定位。虽然ROPK家族形成了一个不同于上述所描述的激酶家族的单独分支，但系统发生分析在ROPK内存在两个主要的分支，其中一个包含ROP2、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8和ROP18等，这个分支一半以上的蛋白是假激酶，只有ROP18是具有活性的激酶。第二个分支包含大多数具有活性的激酶，包括ROP16和ROP38。近年来，这些激酶和假激酶的作用已被广泛研究，主要是调节宿主环境以促进弓形虫自身的生长发育，有的与虫株毒力密切有关。

棒状体在弓形虫入侵细胞早期会分泌棒状体蛋白（ROPs）并参与纳虫泡的形成（Hakimi等，2017）。ROP2、ROP4、ROP5、ROP7、ROP8、ROP17和ROP18均在纳虫泡膜（PVM）上发现，其中一部分棒状体蛋白也可以穿过纳虫泡膜（PVM）进入宿主细胞内。ROP2定位于PVM，敲除ROP2会影响棒状体的生成和胞质分裂，也会影响弓形虫的入侵和增殖能力以及降低对小鼠的毒力。ROP4在弓形虫入侵时分泌到PVM，并且被磷酸化，其作用是维持PVM的功能并可能参与宿主细胞基因表达调控。ROP18、ROP17和ROP5会在PVM表面形成复合物，而ROP5则已被证明是免疫相关GTP酶的变构抑制剂，其作用机制很大程度上是通过与Irga6形成复合物，阻止IRGs的装配并激活ROP18激酶活性。ROP17则可以与IRG寡聚物结合，以增加它们的组装失误。有趣的是，敲除ROP17会导致ROP18的丢失。而苏氨酸激酶ROP18则可以磷酸化IRGs，从而阻止其招募至PVM。ROP18也可以磷酸化宿主内质网定位的转录因子ATF6β，因为ROP18的N端延伸与ATF6β结合并磷酸化ATF6β并传递蛋白降解的信号，从而导致CD8 T细胞介导的免疫反应下调。ROP18/ROP17/ROP5复合物也可以与GRA7结合共同阻止IRGs在PVM上的组装。此外，ROP5和ROP18在小鼠体内也能抵抗GBP的作用，与假激酶ROP45有类似的作用。ROP16可以激活宿主细胞STAT3和STAT6，进而促进白细胞介素-4（IL-4）的产生，抑制促炎因子IL-12的生成。ROP38则会影响众多宿主细胞基因的表达，如下调宿主MAPK信号途径相关基因。值得注意的是，这些棒状体分泌的蛋白同样对Ⅱ型株包囊的形成至关重要。例如ROP5、ROP17和ROP18可以通过间接促进弓形虫的存活，而ROP35、ROP38、ROP29和ROP19则可以通过增加弓形虫的成囊水平来调节小鼠内包囊的形成。

2.棒状体颈部蛋白（RON）

这类蛋白会形成重要复合物参与弓形虫的入侵过程。例如RON2、RON4、RON5和RON8从棒状体分泌后会形成移动连接结构（moving junction）的RON复合物（Besteiro等，2011），参与入侵过程。生物信息学分析预测，RON4、RON5和RON8是可溶性蛋白。RON2预测存在2个膜定位序列，在弓形虫中有两个同源物，另外一个是子孢子特异的SporoRON2/RON2L2。RON4、RON5、RON8与RON2结合并插入到宿主细胞膜中，其中跨膜蛋白RON2在跨越宿主细胞膜后锚定该RONs复合物。此外，RON2也可直接与微线体分泌蛋白AMA1结合共同形成移动连接复合物。

RON9和RON10也会形成稳定的复合物，但不定位在移动连接复合物中。基因敲除RON9和RON10都会导致整个复合物的消失，但不影响弓形虫在体外的增殖以及对小鼠的毒力。RON11和RON12是最近发现的棒状体颈部蛋白，RON11敲除后不影响弓形虫的入侵和增殖。

3.其他棒状体蛋白

ROP1是弓形虫内被第一个鉴定的棒状体蛋白，它是一个可溶性蛋白，在入侵宿主细胞后定位到纳虫泡膜并在24小时内降解。ROP1敲除不影响弓形虫的增殖、入侵和毒力，但会改变棒状体的超微结构，可能与棒状体结构的稳定有关。ROP6分泌后表现出蛋白酶活性和宿主细胞结合的特征。ROP9是一个速殖子的可溶性蛋白，其功能未知。ROP21和ROP27定位在纳虫泡和包囊基质内，而ROP21、ROP27、ROP28和ROP30分别和共同敲除均不影响弓形虫的增殖和包囊形成。但当共同敲除ROP21和ROP17后，小鼠体内形成的包囊数可减少50%。ROP33，ROP34和ROP35可以被分泌到纳虫泡中，ROP35是具有催化活性的，它可以磷酸化GRA2和GRA6，调节IVN的组装和维持其正常运作。ROP47分泌后会被转移到宿主细胞核，敲除ROP47和48对弓形虫毒力和增殖没有明显影响。ROP54在入侵时分泌并定位到PVM的胞质面，敲除弓形虫PRU虫株的ROP54并不影响其在体外的增殖，但会降低其对小鼠的毒性。研究发现ROP54可以修饰GBP2从而促进弓形虫感染。

棒状体内也存在一些其他蛋白酶，如枯草杆菌样蛋白酶SUB2，它被预测为具有保守催化结构域的膜结合蛋白，可以与ROP1、ROP2和ROP4免疫共沉淀。基于与真核生物半胱氨酸蛋白酶的同源性分析，在弓形虫棒状体中发现一种组织蛋白酶B样蛋白，并被命名为toxopin-1或组织蛋白酶B（CPB）。CPB同时也定位在弓形虫内体样泡（endosome-like compartment）内，用蛋白酶抑制剂抑制CPB的活性会延迟ROP2家族蛋白的加工，导致棒状体生成异常和虫体入侵能力下降。此外，在棒状体中还发现一个胰岛素溶酶样蛋白（toxolysin-1，TLN-1），但其对弓形虫不是必需的，功能尚不清楚。

棒状体上存在一种钠/氢交换酶NHE2。棒状体在成熟的过程中pH值会由酸性（pH 3.5～5.5）变化为中性（pH 5.0～7.0）。NHE2的功能可能涉及在棒状体成熟过程中pH的调节。

Toxofilin是一种27kD的蛋白质，已被证明可以与哺乳动物的G-肌动蛋白结合，是一种肌动蛋白隔离蛋白，覆盖着肌动蛋白丝。弓形虫toxofilin最初被认为存在于弓形虫顶端的胞浆中，并参与速殖子入侵和运动过程中肌动蛋白的聚合。后续的研究还发现，toxofilin定位在棒状体并分泌到宿主细胞内改变宿主肌动蛋白细胞骨架，促进弓形虫入侵。

缓殖子特异的棒状体蛋白BRP1在缓殖子发育时期呈高表达，在裂殖子内也有表达。但是，敲除BRP1后对缓殖子发育和包囊形成过程无显著影响。

（三）致密颗粒与致密颗粒蛋白

1.致密颗粒（dense granule）

弓形虫的致密颗粒为呈球形的电子致密体，直径约0.3μm，单层膜包裹，主要分布在虫体的后端（图2-14）。致密颗粒可以从虫体顶端、侧面及后部分泌免疫活性蛋白进入纳虫空泡内。这些蛋白称作致密颗粒蛋白（dense granule protein，GRA），是虫体在宿主细胞内存活的关键蛋白和重要分泌抗原之一。弓形虫生活不同时期的虫体，其内部的致密颗粒数量存在差异，速殖子和子孢子中大约有15个，缓殖子中有8～10个，而在裂殖子内则仅有3～6个致密颗粒。这些特征可能与不同时期虫体GRA的表达量和纳虫泡形成的类型有关。

2.致密颗粒蛋白（GRA）

致密颗粒在弓形虫入侵后期会分泌GRAs，这些蛋白广泛分布于虫体、纳虫泡膜、纳虫泡膜与虫体间隙、纳虫泡膜以及宿主细胞内（表2-1）。它们的主要作用有：①参与纳虫泡膜的形成与成熟；②参与包囊壁的形成；③分泌到纳虫泡膜外表面和进入宿主细胞核，影响宿主细胞基因的表达；④参与宿主与纳虫泡内的小分子转运（Mercier和Cesbron-Delauw，2015）。

致密颗粒在成熟后会被分泌到不同的区域，其中GRA1、GRA8定位在纳虫泡空间区域；GRA2、GRA4、GRA6、GRA9和GRA12与IVN结合；GRA3、GRA5、GRA7、GRA8、GRA14、GRA19、GRA20、GRA21、GRA23和GRA10、GRA15、GRA22、GRA24、GRA25定位于纳虫泡膜（PVM）；GRA15、GRA16、GRA18、GRA24和TgIST则可以分泌出纳虫泡进入宿主细胞核内。虽然这些蛋白并没有同源性的结构，但它们仍然具有一些相似的特征，包括都是分子量相对较低的单体蛋白（20～75kD）；都具有N端疏水信号肽；分泌到纳虫泡膜的GRAs通常通过单个疏水性α-螺旋结构域连接到膜上。

GRA1是第一个被鉴定的GRA蛋白，它在纳虫泡内是可溶性蛋白。GRA会被分泌到宿主细胞的吞噬泡内，并具有钙离子结合能力，可能参与弓形虫的入侵。在弓形虫RH虫株中敲除GRA2和GRA6后证明，它们与纳虫泡内IVN的形成有关。GRA2通过它的两性α螺旋，诱导弓形虫入侵后纳虫泡内后端的IVN小管的形成，而GRA6则进一步稳定这些预先形成的膜质小管。GRA2和GRA6的敲除均不影响弓形虫在体外的增殖，但降低对小鼠的毒力。GRA6也可以激活宿主的转录因子NFAT4（活化T细胞4的核因子），促进趋化因子Cxcl2和Ccl2的合成。GRA3定位在纳虫泡内网络和纳虫泡膜上，GRA3基因在弓形虫Ⅱ型虫株中被同源重组替换后，发现其既不影响弓形虫的增殖或分化，也不影响其他GRA的定位，只降低其对小鼠的毒力。GRA7与ROP17功能类似，它被组装在ROP18/ROP17/ROP5复合物中，直接与宿主细胞的IRGs结合并破坏其功能。GRA8在弓形虫入侵期间和入侵后不久被释放到纳虫泡中，并定位在纳虫泡膜周围，但其功能暂不清楚。GRA9与GRA2、GRA4和GRA6一样，定位在管状膜网络IVN中，它从虫体前端分泌到纳虫泡内但不转移到虫体后端IVN形成的后端内陷处，说明它不参与IVN的形成和扮演有用的角色。GRA10可以被分泌到宿主细胞核仁并与TAF1B相互作用，可能参与调控宿主细胞rRNA的合成。GRA11A和GRA11B在裂殖子中特异表达，定位在纳虫泡内以及纳虫泡膜上。GRA12与GRA2和GRA6的定位相似，它在弓形虫入侵宿主细胞后不久便从弓形虫前端分泌到纳虫泡内，随后转移到IVN小管最初形成的地方，即弓形虫的后端内陷处，并保留在纳虫泡内与IVN结合。在缺失GRA2的情况下，GRA12不能在弓形虫的后端定位，推测GRA12可能与GRA2和6一样参与IVN的功能。GRA14也定位于IVN中，其C端面向宿主细胞质，N端面向纳虫泡腔。实验结果表明，敲除GRA14的虫株与野生虫株之间可以交换GRA14，说明它可以被分泌到外界环境中并转运。GRA15定位在纳虫泡膜表面并激活宿主的P50/P65 NF-κb，从而促进炎症分子IL-12的分泌。GRA16会被分泌到宿主细胞核，与高分子量的复合物（包括PP2A-B55和HAUSP）结合，以控制p53的水平。GRA17和GRA23位于纳虫泡膜，它们负责宿主细胞质和纳虫泡之间的小分子运输。GRA18被分泌到宿主细胞质形成复合物与GSK3/PP2A-B56结合，诱导β-连环蛋白（β-catenin）的上调表达并影响下游的宿主细胞基因表达。GRA18可以诱导一系列与抗炎反应相关的特定基因的表达，其中包括趋化因子CCL17和CCL22。GRA22在N端有一个信号肽，负责其在致密颗粒和纳虫泡的定位。GRA22敲除弓形虫生长速度正常，但会提前逸出，说明GRA22可能涉及调控弓形虫的逸出过程。GRA24与GRA16一样具有到达宿主细胞核和调节基因表达的能力。GRA24作为一种弓形虫衍生的激动剂，可以绕过经典的丝裂原激活蛋白激酶（MAPK）磷酸化级联反应并诱导持续p38α的自磷酸化，形成能够激活转录的复合物，如EGR1或c-Fos。GRA25是一种磷蛋白，被分泌到纳虫泡内，敲除GRA25的弓形虫Ⅱ型虫株在体外感染巨噬细胞后，与野生型虫株感染相比，巨噬细胞会分泌更少的CCL2和CXCL1。在感染了弓形虫的小鼠发现，敲除GRA25的弓形虫其对小鼠的致死率比野生型虫株要低，说明敲除GRA25会导致弓形虫毒力下降。GRA28可以被分泌到宿主细胞核，但其功能未知。敲除GRA38和40没有明显的表型，但敲除GRA39会导致弓形虫增殖速度下降以及纳虫泡内明显的脂质积累。缺失GRA39的弓形虫在体内表现出明显的毒性降低，包囊形成数较少。GRA35、42、43定位到纳虫泡膜参与激活LEWIS大鼠细胞的细胞焦亡途径（pyroptosis pathway），敲除这些蛋白不会激活细胞的NLRP1细胞焦亡途径，因此弓形虫在体外培养的LEWIS大鼠巨噬细胞内能够增殖，但在体内，这些敲除虫株没有明显的表型。GRA54定位到纳虫泡内，与GRA7共定位。TgIST通过将Mi-2/NuRD抑制因子复合物招募到干扰素应答基因启动子区域的STAT1结合位点处，从而阻止干扰素基因应答基因的表达。

最新的蛋白质组学研究发现位于包囊壁上一些新的GRA蛋白（Tu等. 2019），包括CST2/GRA47、CST3/GRA48、CST4、CST5/GRA49、CST6/GRA50，敲除CST2后可导致弓形虫毒力降低，且不能在小鼠体内形成包囊。

（四）微线体、棒状体和致密颗粒的成熟及蛋白转运

分泌器官微线体、棒状体和致密颗粒都是通过囊泡出芽、运输和融合机制形成的。一些经典的内吞转运调节因子已被证明参与了分泌器官的形成，包括Sortilin受体（sortilin）、动力蛋白相关蛋白B（DrpB）、Rab5A/C、RAB7、空泡蛋白分选相关蛋白（VSP），网格适配器蛋白1（TgAP1）、BEACH结构域蛋白、N-乙基马来酰亚胺敏感融合因子（N-ethylmaleimide-sensitive fusion factor，NSF factor）和SNARE蛋白等（Morlon-Guyot等，2015；Venugopal和Marion，2018）。

Sortilin是一种真核生物保守的跨膜高尔基体受体，介导高尔基体、内体、溶酶体和质膜之间的蛋白质和囊泡运输。条件性敲除弓形虫Sortilin会对棒状体和微线体的成熟造成严重的影响。有趣的是，最近的一项研究发现，PfSortilin除了在恶性疟原虫顶端分泌胞器发生中发挥作用外，还参与了内膜复合体（inner membrane complex，IMC）的形成。弓形虫的DrpB定位于高尔基体和内体样结构附近，参与棒状体和微线体的形成，而弓形虫的TgDrpB基因突变会导致分泌蛋白错误地分泌到纳虫泡中。Rab5A和C定位于早期的内体样泡，过表达位点突变的TgRab5A后，MIC3、MIC8和MIC11都会错误定位到纳虫泡内，然而一些其他的MIC蛋白MIC2、AMA1和M2AP能够正确地定位，说明MIC蛋白存在不同的运输和分选途径。TgRab7定位于后期的内体样泡中，同样涉及微线体的形成。

哺乳动物的内体系统包含产生内体和溶酶体所需的两个重要的同源聚合物CORVET和HOPS。CORVET主要与早期内体有关，而HOPS主要与晚期内体、溶酶体有关，HOPS和CORVET蛋白复合物包括一个相同的4个亚基组成的核心和两个额外的囊泡特异亚基。它们的核心亚基被命名为Class C Vps蛋白，包括Vps11、Vps16、Vps18和Vps33。CORVET包含额外的Vps3和Vps8亚基，控制晚期核内体的运输并与Rab5 / Vps21-GTP相互作用。HOPS包含额外的Vps39和Vps41亚基，在溶酶体泡中起作用，控制着晚期内体向溶酶体泡的转运过程，并与Rab7/Ypt7-GTP相互作用。比较基因组分析表明弓形虫内存在同源的核心亚基Vps11、Vps16、Vps18和Vps33以及HOPS上的额外亚基Vps39和Vps41，但没有在CORVET上鉴定出Vps3和Vps8亚基，只发现有Rab5和Vps9的同源物。TgVps11是HOPS和CORVET装配的支架蛋白，对HOPS和CORVET复合物的稳定至关重要。TgVps11定位在弓形虫的高尔基体、内体囊泡以及未成熟的顶端分泌胞器内，诱导敲降Vps会引起TgRab7在内体样泡中的错误定位，并破坏微线体、棒状体和致密颗粒的生物发生，导致弓形虫无法入侵宿主细胞。对微线体而言，在Vps敲降的虫株，AMA1的定位受到部分影响而MIC2的定位则完全未受影响，相反，MIC3和MIC8蛋白的定位则完全改变。单独敲除TgVPS8、9、11、18和网格适配蛋器白1（TgAP1）都只会影响一个微线体蛋白亚群（MIC2、MIC6和顶部膜抗原1）的分泌，使这些蛋白只能滞留在微线体内，而其他的微线体蛋白则被错误地分泌到到囊泡中。这些结果进一步支持了两类微线体的存在，而且它们执行不同的蛋白转运途径。TgAP1μ亚基的条件性敲除会影响众多微线体蛋白的定位，例如可溶性的MIC3和MIC4会错误定位到纳虫泡内，跨膜的MIC8主要滞留在反面高尔基网（trans Golgi network，TGN）中，在细胞膜处定位减少，MIC2和M2AP聚集在一小群顶端定位的微线体内但不会定位于高尔基体也不会被分泌出去。同样的，跨膜的MIC6和AMA1也在顶端的微线体中积累。这些发现表明TgAP1可能不影响MIC2和M2AP从高尔基体向微线体的运输，但对MIC3/MIC8和MIC1/MIC4/MIC6复合物在内质网上的稳定具有重要作用。敲除定位在高尔基体的网格蛋白重链1（CHC1）会导致高尔基体的变形，进而引起微线体、棒状体以及表膜的形成受阻。

弓形虫sortilin-like受体TgSORTLR是一个必要的受体用以新合成的ROP和MIC蛋白在高尔基体和内体间的转运。TgSORTLR定位在高尔基体和TgRab5和有TgRab7标记内体附近的囊泡上。条件性敲除TgSORTLR会破坏弓形虫棒状体和微线体的生成，MIC和ROP蛋白加工受影响，生成的MIC和ROP蛋白被滞留在分选囊泡、细胞质和细胞膜上，进而影响弓形虫的入侵和逸出过程以及毒性。这些结果说明TgSORTLR在MIC和ROP蛋白成熟前就起作用。TgSORTLR的胞质尾部结构域被证明参与蛋白质正向和逆向的转运，包括AP1衔接蛋白（β，γ和μ1）和Vsp26、Vps29和Vps35的转运。有推测模型解释，在子代细胞分裂时，TgSORTLR与微线体、棒状体以及胞质内的货物运输蛋白TgAP1在高尔基体结合形成一个分选复合物，随后从高尔基体移出到早期和晚期内体，运输完成后TgSORTLR会再次返回高尔基体。

可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体（soluble n-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor，SNARE）是真核生物中广泛保守的蛋白，介导囊泡融合，在弓形虫中也参与微线体的分泌。SNAREs的功能是通过与待融合膜上的跨膜SNARE蛋白相互作用完成的。在相互识别后，辅助因子会被招募到SNAREs上形成一个功能融合复合体，这种复合体产生的力使膜弯曲，导致脂质的积聚从而产生足够的力使膜融合。在弓形虫中已经鉴定出23个SNARE样蛋白，但至今只有syntaxin 6被阐明参与致密颗粒的形成。

1.微线体蛋白的成熟

微线体蛋白分泌是由一个复杂信号通路介导，涉及钾和环核苷酸浓度水平变化以及胞内钙离子水平升高的过程。微线体蛋白的分泌是由鸟苷环化酶催化产生环状单磷酸鸟苷（cGMP）并激活蛋白激酶G开始的（Bullen等，2016）。蛋白激酶G会激活磷脂酰肌醇4-激酶从而将磷酸酰肌醇磷酸化为磷脂酰肌醇4-磷酸，通过磷脂酰肌醇4，5-二磷酸激酶的作用进一步转化为磷脂酰肌醇4，5-二磷酸（PIP₂）。弓形虫的磷脂酶C位于弓形虫的外围，其作用是裂解磷脂酰肌醇4，5-二磷酸以产生三磷酸肌醇（IP₃）和二酰基甘油（DAG）。三磷酸肌醇可以刺激细胞内的钙离子释放，从而激活钙依赖性蛋白激酶（calcium-dependent protein kinases，CDPK）。CDPK可能参与某些微线体分泌和肌动球蛋白系统激活的蛋白磷酸化。条件性敲除CDPK1会影响弓形虫微线体的分泌，入侵和增殖。CDPK激活后，微线体的分泌是一个依赖SNARE-样蛋白DOC2.1参与的融合过程。DOC2包含一个可以与钙离子结合的串联C2结构域并涉及钙离子介导的胞外分泌，促进分泌囊泡与细胞膜融合。同时DAG通过二酰基甘油激酶1（DGK1）的作用在弓形虫质膜内转化为磷脂酸，TgDGK1基因的条件敲除不仅导致微线体分泌出现缺陷，而且由于二酰基甘油（DAG）的积累和磷脂酸（PA）的耗竭，还会导致细胞膜完整性的严重丧失。除了TgDGK1，弓形虫中还有另外两个DGK即DGK2和DGK3，它们在虫体内表现出不同的定位，TgDGK2定位于致密颗粒，并在纳虫泡中积累，而TgDGK3则定位于微线体，但是有关DGK2和DGK3的功能至今未明。根据定位人们预测它们对信号的转导以及弓形虫的分泌具有重要作用。磷脂酸（phosphatidic acid，PA）对弓形虫的运动、入侵和逸出具有重要作用，如滑动体（glideosome）相关连接蛋白可以通过其C端的结构域与磷脂酸发生特异性的相互作用。因此，磷脂酸作为一种脂质介质，可以通过与GAC相互作用来释放黏附素与肌动球蛋白系统的结合，从而促进弓形虫的滑行运动。顶复门内一种新型的保守磷脂酸感受蛋白APH可以通过其N端的磷脂结合域结合磷脂酸。TgAPH通过N-端肉豆蔻酰化和棕榈酰化作用锚定在微粒体表面，并被募集到富含磷脂酸（PA）的膜上，最终通过未知的途径介导微线体的分泌。TgAPH对弓形虫的存活是必需的，敲除会导致弓形虫死亡。TgRNG2是一种顶极环蛋白，以前有报道称该蛋白有助微线体的分泌，但不影响微线体的结构完整性，TgRNG2敲除导致的微线体分泌缺陷仅发生在速殖子受到磷酸二酯酶抑制剂Zaprinast的刺激时发生，而在钙离子载体A23187补充钙离子后分泌正常。目前人们还不清楚TgRNG2在微线体分泌过程的具体作用。葡萄糖磷酸异构酶旁系同源基因的隔膜蛋白（parafusin）涉及钙离子介导的途径，弓形虫有两个Parafusin，即parafusin相关蛋白1（TgPRP1）和葡萄糖磷酸异构酶2（TgPGM2）。目前，人们只知道TgPRP1定位于顶端的微线体。TgPRP1和TgPGM2的单敲除和双敲除，证明其对弓形虫的存活没有可见的影响，但会破坏钙离子诱导的微线体分泌过程。以前有研究认为TgCEN2参与底部复合物的收缩，但最近的研究发现TgCEN2的敲除也会导致微线体分泌的缺陷，对弓形虫的黏附、运动、入侵和逸出产生严重的影响。这些发现表明，除传统的分泌途径外，微线体也可能具有其他的分泌途径。

2.微线体蛋白转运

微线体蛋白（MIC）是在细胞核合成并经内质网-高尔基体-内体样泡过程逐渐加工成熟和转运的，其中除了上述的一些因子外，一些特异的蛋白也会参与微线体蛋白的转运。

跨膜的微线体蛋白MIC6被证明参与两个可溶性的黏附素MIC1和MIC4的运输，MIC6胞质位点的缺失会导致这些蛋白滞留在高尔基体和内质网而不能转移到表面。同样，跨膜的MIC2与可溶性的M2AP形成多聚体复合物，从内质网和线粒体开始，M2AP的前肽作为一个分选位点，帮助复合物通过早期和晚期的内体最终进入微线体。敲除M2AP的前肽后，M2AP不能与黏附蛋白MIC2稳定结合，尽管其复合物可以成功地通过内质网、高尔基体和早期内体样泡，但不能被运输到晚期的内体样泡中，最终导致两种蛋白都不能正常分泌。与M2AP前肽相比，MIC5前肽似乎在分泌系统的早期阶段就行使功能，因为在敲除MIC5前肽后，蛋白运输到早期内体即出现缺陷。早期的研究结果认为，跨膜蛋白MIC8直接或间接地与MIC3相互作用并协助可溶性黏附素MIC3分选到微粒体中。然而，新近的研究表明，MIC3在敲除MIC8的虫体中可正确定位在微线体，说明MIC3向微线体的转运并不依赖于MIC8。这些结果表明，尽管微线体的前肽定位在不同的位置，但它们对分泌蛋白的转运具有重要的作用。

转运蛋白家族蛋白（transporter family protein，TFP）被认为是一种重要的转运蛋白。TFP1定位于微线体和内体样泡，TFP2和TFP3定位于棒状体，而TFP4则定位在高尔基体。TFP1对弓形虫的适应和生存起着至关重要的作用，而这个家族的其他成员是非必需的。TFP1的条件性敲降会破坏微线体的生成，使微线体数量明显减少，形态出现严重改变，从典型的杆状结构变为较大的卵圆形结构，导致分泌功能完全丧失，阻碍细胞的运动、附着、入侵和逸出。基于形态发生的研究结果表明，TFP1参与了微线体的压缩。TFP2的缺失可导致棒状体从棒状型变成细长型，但不影响其蛋白的丰度、加工和分泌。目前，TFP1与定位在棒状体上的TFP2和TFP3以及高尔基体上的TFP4的作用底物尚不清楚。

弓形虫的微线体与膜下微管相邻，有些蛋白被鉴定出可以通过膜下微管定位和运输微线体。动力蛋白轻链8a（TgDLC8a）是微管运动复合体的关键组成部分，被证明是可以将微线体运输到分泌部位。TgDLC8a定位于顶端、纺锤体极、中心粒和基底端。TgDLC8a的条件性敲除可导致微线体分泌功能出现明显缺陷，入侵受到严重影响，但虫体的逸出、运动和附着正常。此外，TgDLC8a似乎也参与微线体蛋白向顶端的持续运输过程，以维持微线体的连续分泌。

许多MIC最初被合成为前体蛋白，在运输到微粒体的过程中经历蛋白水解过程而成熟。其中，内体的组织蛋白酶L（cathepsin L，CPL）被认为是促进MIC成熟的蛋白酶之一。CPL定位在内体样泡以及植物样泡内，在弓形虫分泌过程中处理微线体前体蛋白。敲除CPL会导致M2AP和MIC3的成熟延迟，而MIC6和AMA1则没受影响，所以极有可能CPL只对某些MIC蛋白进行处理。重组的CPL在体外能够剪切重组的M2AP，证实其对微线体蛋白的作用。MIC蛋白在分泌到弓形虫表面后也会被加工。这些分泌后处理的现象可能是将MIC复合物进行水解以及在弓形虫入侵过程结束时解离虫体与宿主相互作用的蛋白。行使这些功能的是菱形的丝氨酸蛋白酶家族。弓形虫菱形样蛋白酶1（ROM1）定位在微线体，ROM4和ROM5定位在细胞膜表面。ROM4沿弓形虫细胞膜表面均匀分布，而ROM5则定位在弓形虫后端。ROM4和ROM5的作用是水解固定在虫体膜表面的MIC蛋白的C末端。研究结果表明，ROM4参与MIC2的剪切，敲除ROM4会导致弓形虫MIC2的脱落明显减少，使MIC2在弓形虫表面积累增加，造成对宿主细胞的黏附增强，运动力下降，最终降低其对宿主细胞的入侵力。

3.棒状体的成熟和蛋白转运

棒状体的生物发生是由高尔基体中新合成的蛋白质囊泡出芽驱动的。成熟的棒状体由不成熟的前体胞器（称为前棒状体）发育而来，前棒状体通常是位于分裂的弓形虫高尔基体和顶端区域之间的囊泡，随着分裂的进行，前棒状体通过压缩和颈部区域向锥体伸长而发育成棒状体。

棒状体蛋白的分选机制与MICs蛋白类似。ROP2和ROP4，分别含有一个双亮氨酸位点和一个基于酪氨酸的分选序列（YXXΦ位点），这两个位点均能被TgAP1所识别。TgAPμ1定位于高尔基体、高尔基体反面网络、高尔基体相关的囊泡和棒状体，识别棒状体上的YXXΦ位点帮助棒状体从前期内体转移到前棒状体中。过表达位点失活的TgAPμ1会影响其与ROP2 YXXΦ位点结合，导致ROP2的分选过程出错和棒状体的生成缺陷。研究表明ROP2前肽在成熟的棒状体内可被组织蛋白酶B和toxopain-1剪切，说明相对于微线体蛋白，有些棒状体的成熟可能发生在分泌途径的后期。TgRab5A和TgRab5C也参与调控棒状体的生物发生，TgRab5A与TgAPμ1的功能相似，调节早期内体棒状体蛋白的转运。过表达位点失活的TgRab5A和TgRab5C都会抑制棒状体的形成，导致棒状体蛋白被滞留在运输泡内，相反TgRab7的位点失活不影响棒状体的生成，说明棒状体蛋白的加工和转运不需要后期内体的参与。这些发现说明蛋白质向棒状体的转运是通过内部囊泡途径进行的，特别是前期内体，并可能是通过衔接蛋白的活性介导。尽管基于酪氨酸的分选基序可能解释跨膜ROP蛋白的靶向性，但不能解释可溶性棒状体蛋白的分选机制，通过研究，发现可溶性ROP1蛋白的前肽和中心肽涉及其分选。

棒状体蛋白的分泌可能与Ferlin蛋白有关。Ferlin属于一个含有多个C2结构域的蛋白质家族。弓形虫有三个假定的Ferlin。Ferlin 2（TgFER2）定位于顶端（富集于锥体）和底部，敲除TgFER2导致弓形虫棒状体蛋白分泌异常但不影响微线体蛋白的分泌。TgFER1和3功能还有待确定，推测TgFER3可能参与微线体蛋白的分泌。

弓形虫棒状体膜上有一种保守的称作弓形虫犰狳重复蛋白（armadillo repeats only protein，TgARO）的酰化蛋白。条件性敲除TgARO会导致棒状体在胞质随机分布以及弓形虫入侵功能的严重缺陷，但对弓形虫胞内生长和逸出没有影响。TgARO的酰化/棕榈酰化是由定位于棒状体的弓形虫TgDHHC7蛋白（a member of the Asp-His-His-Cys cysteine-rich domain/DHHC-CRD family protein acyl transferases/PATs）介导的。敲低TgDHHC7也会造成棒状体分散在细胞质内。免疫共沉淀实验发现，ARO可以与肌球蛋白F（TgMyoF）、一种棒状体颈部定位的ARO相互作用蛋白（AIP）以及腺苷酸环化酶β（TgACβ）相互作用，敲除TgMyoF会导致顶部的棒状体脱落并在分裂余体上堆积，说明棒状体的顶端定位是一个以肌动球蛋白为基础的过程。基因敲除TgAIP表明TgACβ需要TgAIP的作用来定位于棒状体。

4.致密颗粒的成熟和蛋白转运

致密颗粒的成熟同样需要DrpB、TgStx6和HOPS复合物的参与，通过这些蛋白的作用将从高尔基体产生的囊泡向致密颗粒运输。致密颗粒与微线体和棒状体不同的是，其在胞质内并不是静止的，其内蛋白的分泌需要致密颗粒自身的运动（Heaslip等，2016）。致密颗粒主要表现为定向运动或随机的扩散样运动，只有一小部分颗粒是固定不动的。致密颗粒的运动依赖肌动蛋白丝的参与，解聚或肌动蛋白敲除会导致致密颗粒的运动几乎消失。TgMyoF的缺失与肌动蛋白类似，也会导致致密颗粒运动的显著减少，这些结果说明致密颗粒的运动是依赖肌球蛋白的方式来转运的。

致密颗粒蛋白的分泌具有与常规分泌通路共同的特征：①在电子致密小泡内包装；②小泡与膜融合；③不受钙信号调节。致密颗粒的分泌与棒状体蛋白的分泌不同的是，致密颗粒蛋白（GRA）不直接分泌到宿主细胞质中，而是先分泌到纳虫泡空间中，然后再重新定位。一些GRA蛋白参与PVM内IVN的形成，其他的则被整合到PVM上或分泌到细胞外，介导多种功能。定位于弓形虫高尔基体的天冬氨酸蛋白酶5（ASP5）会处理和转运多数包含有PEXEL-like位点的致密颗粒蛋白如GRA16以及部分不带有PEXEL-like位点的致密颗粒蛋白如GRA24。GRA16预测有5个核定位信号和2个内部重复序列，其中一个含有“RRL”TEXEL（弓形虫转运元件）序列。弓形虫ASP5对TEXEL序列的剪切对GRA16从PVM中的运出至关重要。GRA24包含一个内部双向核定位序列和两个内部重复序列，它没有TEXEL基序，但仍需依赖ASP5进行转运。敲除ASP5在体外并不影响弓形虫的增殖，但会严重影响弓形虫对小鼠的毒力。敲除依赖ASP5进行转运的GRA14会出现同样的表型，说明ASP5参与的转运对弓形虫毒力的重要性。致密颗粒蛋白的向外转运也需要PVM上的3种Myc调控蛋白MYR1、MYR2和MYR3的参与。MYR1可以被ASP5裂解成两个片段并可以和MYR3在PVM上通过N和C末端片段的二硫化物连接形成稳定的复合物。MYR2则位于PVM的外围，但尚未发现它与另外两种MYR蛋白有关联。三个MYR基因中任何一个的缺失都会导致GRAs转运的缺失，如GRA16和GRA24。敲除MYR1后，弓形虫对宿主基因转录的影响降低，对小鼠的毒性也显著减弱。基因筛检也发现棒状体蛋白ROP17是大多数GRA蛋白从PVM向外转移所必需的。ROP17敲除会导致GRAs转运的缺陷，但通过感染同一宿主细胞的野生型速殖子传递的ROP17，可以回复敲除虫株的GRA转运。这说明ROP17在调节GRAs转位中的作用是在PVM的宿主细胞质中，而不是在虫体内或纳虫泡内进行的。以上结果揭示了一个GRA蛋白向外转运的重要途径：即GRA蛋白首先经ASP5处理，然后运输到PVM，随后经MYR和ROP17的作用再运输到纳虫泡之外。

四、内共生细胞器：顶质体和线粒体

（一）顶质体

顶质体（apicoplast）也即顶复门原虫的质体（plastid），是顶复门原虫中除隐孢子虫外所独有的、不可或缺的细胞器，与植物及藻类的叶绿体同源。弓形虫速殖子的顶质体位于细胞核和高尔基体的上部，具有4层膜结构（图2-15A、B）。每个虫体仅有一个顶质体。包囊内缓殖子的顶质体同样位于细胞核的附近。值得注意的是，在体外对包囊和缓殖子的研究发现，部分（大约10%～20%）缓殖子丢失顶质体，这些缓殖子不能再进行增殖和转化为速殖子，而只能在包囊内存活，但在体内并没有发现这种现象，这有力地说明体内和体外培养弓形虫的差异。有性生殖阶段的雄雌配子体和雌配子的顶质体呈压缩的球状，而雄配子则丢失顶质体。

1.顶质体的起源和发现

顶复门寄生虫的顶质体来源于内共生过程，这个过程包括异养的真核生物摄取自养的藻类，随后藻类细胞器减少，基因从藻类核基因组转移到异养真核生物的基因组，最终导致了藻类整合为一个细胞器。顶质体是一个由多层膜包裹的胞器：最内两层膜起源于藻类的叶绿体，中间一层来源于藻类的细胞膜，最外一层源于宿主内膜。顶质体首先在恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）中发现。从疟原虫的基因组测序中，人们发现有一个大小35kb的环形基因组，起初该基因组被认为是来源于线粒体，但其编码的基因显然不是传统的线粒体基因，而是与叶绿体编码基因类似，最终确认这个基因组既不是来自细胞核也不是来自线粒体，而是从光合祖先叶绿体残留下来的。对弓形虫顶质体的基因组测序后发现，其与疟原虫类似。20世纪90年代中期，通过电子显微镜原位杂交发现，这段35kb DNA定位于弓形虫内的一个4层膜腔室内，这个胞器最终被命名为顶质体。顶质体基因组编码30个蛋白质，2个rRNAs和25个tRNAs。

2.顶质体的发生

在电镜下可以明显观察到顶质体有四层膜结构。普遍认为顶质体是由次级内共生（sencondary endosymbiosis）产生（van Dooren和Striepen，2013）。第一次内共生过程是由异养真核生物吞噬蓝细菌而形成一级质体，随后含一级质体的红藻被原生生物吞噬而形成二级质体，通过二次共内生过程产生了囊泡藻界（Chromealvelata）。囊泡藻界包括硅藻类（diatoms）、甲藻类（dinoflagellates）和顶复门原虫（Apicomplexans）。然后，随着演化，顶复门原虫成为寄生性生物，随后失去了一级质体具有的光合作用功能，并随动物扩展和多样化而转移到陆生动物。而现存的褐藻（Chromera velia）被认为是由该内共生过程产生，但保留了其光合作用功能。因此，顶质体的产生过程体现了其在虫体内的意义。就其膜结构的来源，其内部的两层膜结构源自于一级质体，演化上与现今的叶绿体同源，最外面一层与原始的原生生物的内膜系统存在同源，而第三层膜则与红藻质膜具有同源性。由于其膜结构的复杂性，顶质体蛋白的转运途径一直是研究的难点。

核编码的顶质体蛋白从内质网腔到最外层膜的运输途径仍有争议。最初，弓形虫和恶性疟原虫（P. falciparum）的实验证据均表明，从内质网到顶质体的转运独立于高尔基体，因为使用转运抑制剂布雷菲德菌素（brefeldin）处理或在蛋白上添加内质网回收信号均不影响顶质体蛋白的转运。然而，在恶性疟原虫的另一项研究中发现，将内质网回收信号添加到核编码的顶质体蛋白中，可以减少蛋白的转运和转运肽的处理，这表明高尔基体可能也在转运中发挥作用。这些矛盾的结果说明，顶质体蛋白的转运可能存在两种不同的途径。最近的研究结果发现，弓形虫的硫氧化还原蛋白（TgATrx）控制着顶质体的形成、蛋白转运以及基因表达（Biddau等，2018）。TgATrx1定位于顶质体的周围以及细胞质的转运泡内，参与蛋白从内质网到顶质体最外层膜的转运，推测其作用可能是促进顶质体蛋白从内质网组装到转运泡内。TgATrx1的缺失会导致顶质体蛋白的减少，而且完全敲除对弓形虫是致命的。TgATrx2也定位在顶质体周围，TgATrx2的缺失则导致顶质体转录水平以及基因组拷贝数的降低，说明其控制着顶质体的基因表达。ATrx2蛋白共沉淀实验也发现ATrx2可能与基因表达中起作用的蛋白结合，并发现其通过与翻译和转录蛋白的二硫化物交换介导基因表达。

蛋白穿过顶质体外膜的机制是在顶复门其他物种中首先发现的（Mallo等，2018）。隐孢子虫的次生质体具有染色质，保留了原始残留的内共生细胞核。对其内共生核进行测序表明，它编码内质网相关降解（endoplasmic reticulum related degradation，ERAD）途径的同源物。这些ERAD成分在包括弓形虫在内的多个演化相关生物的核基因组中都存在。ERAD蛋白通常参与分泌途径中错误折叠蛋白的识别，以及将错误折叠蛋白通过ER膜运送到细胞质中降解。事实上，在顶复门寄生虫中，大家普遍认为它参与蛋白穿越顶质体外膜的过程。在弓形虫顶质体中的确存在ERAD通路中心成分的同源物Derlin1（Der1AP），并被证明是蛋白转运到顶质体的关键组分。弓形虫顶质体的CDC48同源物，是经典的ERAD系统中将蛋白跨膜转运的ATP酶。CDC48的辅因子Ufd1同源物，也在顶质体外周的腔室中发现。CDC48的条件缺失证明其对于顶质体的生物发生和转运至关重要。

顶质体最里面的两层膜是由原始共生体的两层膜演化而来。传统的原生质体利用内、外叶绿体膜（TIC/TOC）蛋白复合物的转座子，分别在最内层和最外层膜上转运蛋白。同样地，弓形虫采用还原性TIC和TOC蛋白复合物，使蛋白质通过顶质体内层膜。弓形虫中属于TIC转座子的植物Tic20和Tic22的同源蛋白定位于顶质体。在植物的原生质体中，Tic20作为孔隙复合体的整合膜蛋白，而Tic22作为伴侣蛋白，这两种蛋白都被证明是顶质体蛋白转运所必需的。尽管与植物Toc75在序列上有较大的差异，但在弓形虫染色质中也发现了植物TOC复合物的主要孔隙组分Toc75的同源物，并定位在顶质体上。进一步的实验证明，TgToc75在顶质体的生物发生和蛋白转运中起着重要的作用。TgToc75突变会导致顶质体基质蛋白的转运丢失，但位于顶质体边缘的蛋白上没有明显的转运缺陷，这一证据说明Toc75介导顶质体蛋白穿过顶质体内层膜进入基质内。

3.顶质体的分裂

在电镜下观察，发现弓形虫分裂中的顶质体总是与中心体相联系，并在其拖拽作用下分裂，然后平均分配到每一个子代个体中。顶质体复制和子代遗传基本模型见图2-16，即顶质体的分裂通过与中心体的复制相联系的模型。中心体位于核的上方且靠近顶质体。在子代虫体形成之前，中心体的复制体和两个子中心体附着在顶质体上。随后中心体分开，顶质体的末端也跟着分开，而顶质体DNA定位在其细胞器的拟核中。当顶质体在分裂前延长成哑铃状时，可以观察到顶质体分裂而形成的两个拟核在两端并靠近中心体。虫体核被重新定位到胞质的基底，并向中心体的方向分裂形成新的核。在子代虫体分裂过程中，中心体始终附着在分裂的顶质体上直至分裂结束，从而确保顶质体的稳定和正确分裂和分离。据报道，Actin、MyoF和FRM2与中心体和顶质体定位和遗传稳定性直接相关，单独敲低任何一种蛋白质，都会导致顶质体的分裂和分离出现缺陷和障碍。此外，定位在顶质体外膜的3-磷酸肌醇和自噬相关蛋白ATG8参与弓形虫顶质体的形成，而DrpA，ATG4、PROP2（又称ATG18）同样对顶质体的分离及维持顶质体的完整性和弓形虫的生存至关重要。

4.顶质体的代谢途径

大部分顶质体蛋白由核编码，这些蛋白翻译后会进入内质网并从内质网运输到最外层的顶质体膜，最终定位于顶质体内各个区域。尽管弓形虫顶质体已经失去了光合作用的功能，但仍参与许多代谢途径，包括脂肪酸、血红素和异戊二烯前体的合成等（Botté和Yamaryo-Botté，2018），并且对虫体的存活是必需的。

（1）血红素合成途径（与线粒体共同作用）：

人类血红素（heme）的合成是在线粒体内完成的，而弓形虫体内血红素的生物合成是通过顶质体、细胞质和线粒体之间的代谢合作完成的。血红素是许多蛋白质的重要辅基，由四吡咯分子组成，其结构中含有螯合离子，即Fe2+或Mg2+。血红素允许蛋白可逆地结合不同的小分子或电子。重要的例子就是血红蛋白，它可以与氧结合并允许其在红细胞中运输。该途径可在三个不同的区域中进行：它始于线粒体，随后进入顶质体中，然后转移到细胞质中，最终在线粒体中结束。

血红素合成的第一步是由线粒体δ-氨基乙酰丙酸合酶催化甘氨酸和琥珀酰辅酶A合成δ-氨基乙酰丙酸（ALA）。ALA随后通过未知的途径转运到顶质体基质，通过基质内的PBG合酶（PBGS）、PBG脱氨酶（PBGD）和六氢尿卟啉脱氨酶（UrpD）依次转化为卟啉原（PBG）、羟甲基胆素、六氢尿卟啉Ⅲ（Uro）和粪卟啉原Ⅲ（CPⅢ）。随后CPⅢ转运到胞质内，被粪卟啉原氧化酶（CPOX）氧化成原卟啉原Ⅸ（PP）。PP随后转运到线粒体内膜区间通过PP氧化酶的作用转化为原卟啉Ⅸ。亚铁螯合酶（FeCHl）最终在四吡咯结构的中心加入亚铁形成血红素b。

（2）铁硫（Fe-S）簇合成：

顶质体中也有一条合成簇的途径。簇是一个活性中心，也称铁硫中心。它是由铁和硫原子通过半胱氨酸残基附着在其蛋白上形成的，在某些酶中起着不可或缺的辅基功能。铁硫簇的作用是接受来自供体的电子并将其转移到受体上，因此具有很强的氧化还原电位。辅基通常在翻译后添加到apo蛋白的肽序列上，从而激活蛋白。

在弓形虫的顶质体中，铁硫簇合成是由SufC和SufE的双重作用起始的。SufC是一种半胱氨酸脱硫酶，催化从半胱氨酸中清除硫化物基团，释放丙氨酸。硫化物基团随后由SufE转移，SufE携带该基团并激活SufC。铁离子很可能来自血红蛋白，然后被添加到硫化物上组成一个前铁硫（Fe-S）簇。这个前铁硫簇被转移到由SufB、C和D形成的支架载体复合物上，形成一个非整合的ABC转运蛋白，能够携带前铁硫簇、转移电子激活铁硫簇以及转移该簇到下一个由ATP水解提供能量的支架复合体。铁硫簇随后被转移到另一个支架NFU上，最终在SufA的催化下转移到目标apo蛋白上。基于研究结果，有人推测有7个蛋白参与顶质体铁硫簇的装配，其中有一个是由顶质体基因组（SufB）编码的，5个（SufC、SufD、SufE、SufS和NFU）带有预测N端转运信号，但只有SufC和NFU已被实验证实是顶质体内蛋白。

（3）脂肪酸代谢：

顶质体参与弓形虫Ⅱ型脂肪酸合成。Ⅱ型脂肪酸合成是典型的细菌和藻类脂肪酸合成途径，由一系列酶介导。酰基载体蛋白ACP作为Ⅱ型脂肪酸合成途径的酶类首先被发现定位于顶质体内。脂肪酸的合成需要乙酰辅酶A，该辅酶由糖酵解产物丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶（PDH）催化产生。弓形虫顶质体的PDH由核编码，它的激活需要E2亚基被硫辛酸转录后修饰。事实上，顶质体内存在合成硫辛酸的两个酶，即LIPA和LIPB。脂肪酸合成的第一步是乙酰辅酶A被乙酰辅酶A羧化酶羧化，弓形虫共有两个乙酰辅酶A羧化酶，生物素标记羧化酶发现，其中一个和顶质体已知的蛋白共定位，另一个则位于细胞质。这些参与脂肪酸代谢的酶类和分子在顶质体内出现证明了顶质体能够参与脂肪酸的代谢。

（4）类异戊二烯的合成：

类异戊二烯的合成是顶质体的另一个重要的生物功能。异戊二烯类化合物是一类重要的天然化合物，在信号传递和蛋白质修饰过程中起重要作用并参与合成辅助因子泛醌（辅酶Q）以及tRNA的修饰。弓形虫顶质体通过由7个酶组成的非甲羟戊酸酯途径（DOXP途径）合成类异戊二烯，最终产生两个异构产物，异戊二烯基二磷酸（IPP）和二甲基丙烯基二磷酸（DMAPP）。

（二）线粒体

弓形虫速殖子只有一个线粒体（mitochondrion），位于细胞的前部，其分支延伸至后部，形成套索状，且具典型的嵴状结构。与哺乳动物细胞存在多个线粒体且其数量随着细胞周期改变而改变不同的是，弓形虫个体中的单个线粒体只有在细胞分裂时才会分离。

1.线粒体的发生

与所有其他真核细胞一样，弓形虫线粒体也由内外两层膜包裹，将线粒体划分为两个不同的隔间，即膜间隙和基质。到目前为止，大多数研究过的线粒体蛋白都含有特定的转运信号，引导它们沿着正确的途径运输到细胞器。在酵母中，线粒体蛋白的转运主要存在6个转运信号（van Dooren等，2016），包括①N端前序列可以导向蛋白到线粒体基质并在基质内被剪切；②含有内部靶向信号的非裂解的多跨膜内膜蛋白的前体；③带有半胱氨酸靶向信号的膜间隙蛋白；④α螺旋跨膜域；⑤β-barrel蛋白和⑥带有C末端的膜锚定蛋白。有关顶复门寄生原虫线粒体蛋白转运信号仅有少数被详细研究过。例如，在弓形虫超氧化物歧化酶B2（TgSOD B2）蛋白的两亲螺旋结构中，发现了其N端前序列，也在弓形虫内发现线粒体靶向膜锚定蛋白（Type 6），如赖氨酸乙酰转移酶TgELp3。

线粒体外膜蛋白转位酶（TOM）是线粒体蛋白转运的第一个通路。酵母的TOM包含一个必要亚基Tom40通道和其他6个亚基：受体Tom20、Tom22和Tom70以及小亚基Tom5、Tom6和Tom7。然而，弓形虫中只有三种TOM成分，即TgTom7、TgTom22和TgTom40。其中TgTom7和TgTom22对TOM复合体的组装至关重要，每一种都是弓形虫生存所必需的，任何一种的缺失都会导致线粒体基质蛋白无法正常成熟。经过TOM复合体的前体蛋白会先滞留在膜间隙等待分选。弓形虫有3类膜间隙蛋白。第一类是会转位到内膜的蛋白，第二类型是与内膜或外膜的膜间隙面结合位点结合的蛋白质，第三类是那些由具半胱氨酸的蛋白形成二硫键结合在氧化的膜间隙环境中的蛋白。这些蛋白是由线粒体膜间隙导入和组装（MIA）机制转运的。MIA机制中有两个主要的组成部分，一个是Mia40和氧化还原酶，它们在这些蛋白前体中识别并形成二硫键，导致其在膜间隙中折叠和保留下来；第二种成分是Erv1，它是一种巯基氧化酶，可以将Mia40再次氧化，从而将其循环利用，进行另一轮前体折叠。虽然顶复门寄生原虫拥有已知MIA底物的同源物，但在它们的基因组中没有发现Mia40同源物，只有Erv1同源物。

线粒体内膜使用一组转运复合载体来控制分子的通过。TIM23是转运复合体的一部分，介导含有靶向序列的基质蛋白转入基质。在酵母中，Tim23是复合体的孔隙，它以动态的方式发挥作用，在不同阶段与不同的蛋白相互作用，Tim17、Tim21、Tim50和Mgr2参与了TIM23-TOM复合物在易位早期的相互作用；Tim44和前体序列转位酶相关马达（precursor sequence translocatase-associated motor，PAM）组成马达复合体，在前体蛋白转位到基质的晚期起作用。在弓形虫基因组中已经鉴定出Tim23、Tim50和PAM亚基Pam18的同源物，并证明它们定位于弓形虫的线粒体。此外，还鉴定了Tim17、Mgr2和PAM的所有组分，说明弓形虫依靠这些途径将蛋白转运到线粒体基质。

2.线粒体分裂

在子代细胞的发育过程中，线粒体在弓形虫胞内分裂时会显著扩张和分支延伸，最终围绕正在生长的子代细胞，线粒体分支在细胞分裂的最后一刻才进入发育中的子细胞，沿着细胞骨架移动，少量的线粒体腔室留在分裂余体内。弓形虫线粒体的分裂机制直到最近才被部分阐述（Voleman和Doležal，2019）。弓形虫编码3个动力相关蛋白DRPA、B和C。TgDrpA和TgDrpB分别参与顶质体、微线体和棒状体的形成。而TgDrpC则与线粒体有关，它在细胞质中呈点状分布，部分邻近线粒体膜，在分裂过程中则会分布到子代细胞的生长边缘。TgDrpC的结构会影响线粒体的功能，导致其形态延长以及其他缺陷。弓形虫从宿主细胞逸出后线粒体的形态也会发生变化，在该过程中，套索状的线粒体会从细胞边缘集中并呈“浓缩”的形态。最近的研究则表明TgDrpC具有相当多的功能，与囊泡转运、胞器的稳定和弓形虫分裂都有关。在敲除TgDrpC的细胞中，高尔基体、顶质体和内膜复合体（IMC）等的形态也发生变化。

3.线粒体的代谢

弓形虫线粒体的代谢与我们所熟知的类似，包括三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle）和将葡萄糖分解为ATP产生能量的电子传递。但是，与传统真核生物不同的是，弓形虫主要依赖糖酵解来产生能量（Xia等，2019）。不同生活史阶段的虫体产生能量的酶也会出现显著的变化。缓殖子糖酵解途径中磷酸果糖激酶的表达量比速殖子要低2～3倍，而葡萄糖-6-磷酸异构酶和烯醇化酶2在缓殖子中则表达明显上升。糖酵解产物丙酮酸会通过乳酸脱氢酶转化为乳酸。在弓形虫生活史中，有两个阶段特异表达乳酸脱氢酶，LDH1在速殖子中表达，而LDH2则在缓殖子表达。缓殖子中的LDH活性大约是速殖子的3倍，说明缓殖子需要LDH来分解包囊中丰富的支链淀粉产生能量。丙酮酸需要丙酮酸脱氢酶产生乙酰辅酶A从而进入三羧酸循环，而前面提到弓形虫的丙酮酸脱氢酶并不在线粒体，而是位于顶质体。因此，有人推测，含有四个亚基的支链酮酸脱氢酶复合物（BCKDH）可能在线粒体中代替丙酮酸脱氢酶催化丙酮酸产生乙酰辅酶A。

五、细胞核、内质网和高尔基体

（一）形态

速殖子的细胞核位于虫体中部，而在缓殖子中细胞核则向后端移动并靠向虫体底部，核仁位于细胞核中部，核膜具有核孔。高尔基体位于细胞核上端，除了上端高尔基体所在区域，其他区域核孔的外部均被核糖体覆盖。高尔基体主要参与细胞的囊泡和蛋白的转运。

弓形虫内质网在细胞核周围，结构与传统真核细胞内质网的类似，包括粗面内质网和滑面内质网，参与囊泡的转运、蛋白的转运和加工以及钙离子的储藏等功能（图2-17）。

（二）功能

弓形虫许多蛋白，包括分泌蛋白（MIC、ROP、GRA）以及顶质体和线粒体蛋白都是在细胞核表达转录后从粗面内质网的管腔进入高尔基体，并通过标准的内质网-高尔基通路转运至细胞其他位置或者细胞外，而顶质体大部分蛋白主要通过高尔基体非依赖和依赖转运途径进行蛋白转运，也即大部分蛋白在内质网核糖体合成后直接转运至顶质体，而顶体体和线粒体双向定位的蛋白则需经过高尔基体转运。弓形虫中所有由高尔基体分泌的蛋白均通过同一途径从腔的顺面转运至反面，随后才被分类转运。GRAs通过蛋白聚集进行分类，与质膜的融合则通过NSF/SNAP/SNARE/Rabs机制介导，MICs和ROPs是按照酪氨酸基序/结合蛋白/网格蛋白途径来分类的，相关途径详见分泌蛋白部分。

六、钙酸体和植物样泡

（一）钙酸体

钙酸体（acidocalcisome）是一类大小约200nm的囊泡状结构，电子显微镜下可在其内观察到具有一到多个电子致密的液滴或晶体，位于核的周围或虫体后端（图2-18）。这一特殊的结构首先在布氏锥虫（Trypanosoma brucei）中发现。钙酸体的特点是内部环境呈酸性，电子密度高，高浓度的磷以磷酸盐、焦磷酸盐和多磷酸盐的形式存在（Miranda等，2008）。X射线显微分析完整的虫体发现，钙酸体中含有大量的氧、钠、镁、磷、氯、钾、钙和锌。钙酸体元素分析检测发现钙酸体内硫的含量较低，表明钙酸体内的蛋白质含量较低。

钙酸体是弓形虫内最大的钙离子库，其表面具有参与Ca2+摄取的细胞膜型的Ca2+-ATP酶（PMCA）以及两个质子泵：液泡型的H+-ATP酶（V-H+-ATPase）TgVATPase和H+-焦磷酸酶（V-H+-PPase）TgVP1，这两种酶都有助钙酸体的酸化。钙酸体的碱化以及磷聚合物的分解会导致其内Ca2+的释放。钙酸体的Ca2+-ATP酶由TgA1基因编码，缺失TgA1的弓形虫突变体对宿主细胞的入侵能力下降，从而导致其在体内外的毒力下降，速殖子中磷聚合物含量急剧消耗，虫体底部Ca2+水平升高但不稳定，微线体分泌也受到影响。补回TgA1可恢复其大部分缺陷，表明Ca2+-ATP酶对弓形虫生存的重要性。

弓形虫钙酸体内存在高含量的以无机焦磷酸盐（PPi）和聚磷酸盐（poly P）形式存在的磷。Poly P是由几个到几百个高能磷酸氢键连接的磷酸盐基的聚合物，而PPi对糖酵解有调节作用。弓形虫中只有三种反应使用无机焦磷酸盐，一种是由磷酸果糖激酶催化的，另一种是由TgVP1催化储存的无机焦磷酸盐产生能量将H+泵入钙酸体以维持其酸化，第三种是由无机焦磷酸酶催化。所有这些酶都是胞质酶，因此存在未知的转运蛋白将PPi从钙酸体转移到胞质。

（二）植物样泡

植物样泡（plant-like vacuole）是虫体内的不同大小的单层泡状结构，相对于细胞质，其内的电子致密物质较少，在电镜下呈白色的空泡状（Miranda等，2010）（图2-18）。弓形虫在胞外以及胞内增殖过程中，植物样泡是一个动态变化的过程。当速殖子在胞外时，植物样泡占据虫体的大部分空间且呈多泡状，而在胞内其体积会明显缩小。植物样泡的作用被认为可以保护弓形虫免受离子和渗透胁迫。

植物样泡膜上也包含液泡型的H+-ATP酶（V-H+-ATPase）TgVATPase和H+-焦磷酸酶（V-H+-PPase）TgVP1以及一些组织蛋白酶如TgCPL和TgCPB、一种水通道蛋白TgAQP1、一个Na+/H+泵以及一个Ca2+/H+泵。植物样泡参与调节胞内离子水平和作为将分泌蛋白分选到高尔基体后的微线体、棒状体和钙酸体的分选室。在弓形虫的胞外阶段，植物样泡不仅在抵抗环境压力方面起着中心作用，而且在随后的入侵宿主细胞方面也起着关键作用。

植物样泡的组织蛋白酶L（CPL）涉及微线体蛋白的加工和成熟，而其自身的成熟则是通过自我加工完成的。研究发现，只有在TgVP1缺失以及TgVATPase被巴弗洛霉素A1（bafilomycin A1）抑制时，组织蛋白酶L的功能才会缺失，表明TgVP1和TgVATPase都能支持组织蛋白酶L加工和成熟。植物样泡上的水通道蛋白TgAQP1的主要功能是运输水或其他能帮助弓形虫应对环境压力的渗透物质。

1.V型ATP酶（V-ATPase）

TgVATPase最初在弓形虫体内被检测到，是由于它对巴弗洛霉素的敏感性。巴弗洛霉素在低浓度时是TgVATPase的特异性抑制剂，可导致钙酸体释放钙离子。TgVATPase定位于钙酸体、植物样泡和细胞膜。V-ATPase是一种进化上保守的质子泵，它通过水解ATP释放能量，将H+跨膜转运至囊泡内。这个蛋白复合物由至少14个不同的亚基组成，它们组成膜锚定的V₀（a、c、c′、c″、d和e亚基）和外围的V1域（A至H亚基）。抑制其a1亚基的表达，会导致弓形虫生命周期中所有主要的步骤都出现严重缺陷和表型变化，包括微线体的成熟和分泌、虫体的入侵、运动和逸出。V-ATPase活性的降低同样会影响微线体蛋白MIC3和M2AP的成熟，导致M2AP、MIC3、前体M2AP、MIC2的定位发生改变，微线体胞器出现定位错误。V-ATPase的酸化作用也与SUB2和ASP3的有效成熟有关，TgSUB2的催化裂解发生在低pH条件下的未成熟棒状体中，未成熟棒状体的酸化将影响TgSUB2的成熟。定位于内体样泡（ELC）的天冬氨酸蛋白酶3（ASP3）对弓形虫的入侵和逸出至关重要。而在V-ATPase活性降低时，ASP3的成熟和活性将受到影响。这些结果说明V-ATPase在棒状体和微线体蛋白正确运输到相应细胞器过程中的重要作用。V-ATPase在弓形虫速殖子的质膜中也起作用，将H+泵出虫体，维持胞内pH稳定。

2.H+-焦磷酸酶（VP1）（Liu等，2014）

TgVP1定位于钙酸体以及植物样泡中，其主要特点是它能够在压力或低氧条件下工作，因为它们不需要ATP。TgVP1的缺失将导致弓形虫一系列的缺陷。首先是黏附和入侵能力的下降，TgVP1缺失的虫株其微线体蛋白MIC2和M2AP定位改变，在敲除虫株中有较高比例个体表现出囊泡分布异常，说明TgVP1缺失可能会导致微线体的合成或蛋白转运异常，从而影响弓形虫的黏附和入侵。TgVP1缺失也会导致弓形虫对细胞外环境更敏感，对小鼠的毒性降低。在低渗透胁迫下，弓形虫速殖子具有调节体积减小的能力，而这种能力在TgVP1敲除虫株中受损，说明TgVP1也参与了渗透以及弓形虫体积调节过程（Stasic等，2019）。

（伦照荣　龙少军　于少猛）