三、HIV核酸定量检测方法及程序

1.检测方法和试剂

目前常用的HIV病毒载量的测定方法有：实时荧光定量聚合酶链反应扩增（real-time PCR）技术、核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence dependent amplification，NASBA）技术、分支DNA（branched-DNA，bDNA）技术，目前国内外经国家市场监督管理总局注册批准且在有效期内试剂的检测靶标均为HIV-1 RNA。

（1）实时荧光定量聚合酶链反应扩增（real-time PCR）技术：

是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程。每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值时所经历的循环数（Ct值）与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准品做出标准曲线，只要获得未知样本的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样本的起始拷贝数。目前此技术已成为大多数HIV-1病毒载量检测试剂采用的主要方法，包括罗氏、雅培、梅里埃等进口试剂及凯杰、达安等主要国产试剂。

（2）核酸序列依赖性扩增（NASBA）技术：

NASBA技术是一种等温扩增系统，代表产品为梅里埃诊断产品（上海）有限公司的人类免疫缺陷病毒（HIV-1）核酸定量检测试剂盒（分子信标实时扩增检测法）。分子信标是包含一段可特异结合靶RNA序列的DNA寡核苷酸片段，当检测样本中存在靶序列时，分子信标与靶序列互补结合，打开发夹结构释放荧光信号，反之荧光信号则被淬灭。同时使用两个不同的分子信标，分别针对野毒株HIV-1和内标物，以内标物来校正检测效率，可通过荧光信号动力学分析计算出原待测样本中HIV-1 RNA含量。

（3）分支DNA信号放大系统（bDNA）技术：

分支DNA信号（bDNA）技术基于其独特的放大系统，分支DNA由人工合成，其分支可结合多个酶标记物，从而将病毒信号放大以便检测。此系统不涉及核酸扩增反应，没有内标记物，每次实验设置一系列外部标记，通过实验样本反应强度与外部标记样本强度的比较确定待检样本的病毒拷贝数。代表产品为西门子医学诊断产品（上海）有限公司的Versant HIV-1 RNA 3.0 Assay（bDNA）试剂，自2016年4月超过国家市场监督管理局批准有效期后未继续注册。

（4）不同方法检测结果间的相互关系：

病毒载量的检测单位有拷贝数（cps/mL）和国际单位（IU/mL），且同一样本不同方法检测的病毒载量结果不同。不同方法间检测结果并无固定的转换关系，与病毒亚型、试剂不同版本有关，因此评估同一病人的治疗效果需用同一种方法检测，并且考虑试剂版本的更新情况。

2.检测程序

（1）样本的采集和处理：

血浆、血清、干血斑、组织器官或血液制本等均可用于检测HIV-1 RNA和DNA，样本的采集和处理参见本章第二节样本的采集、处理和运输。核酸定量检测要求较高，通常采集EDTA抗凝全血8～10mL，采血量应与定量采血管的刻度要求一致，采集后立即轻轻上下颠倒抗凝管10次，使血液与抗凝剂充分混匀。采血后4h内使用离心力800～1 200g（1 500～3 000r/min）离心15min，吸出血浆，分装到贴好标签的无菌聚丙烯螺口冻存管中，并注明分装时间。血浆保存条件根据检测时间而定：4d内可暂存于4℃，3个月内应冻存于-20℃以下，3个月以上应冻存于-70℃以下，不能使用自动除霜冰箱。置于-20℃保存的血浆冻融1次无明显影响，但冻融2次即可降低0.26lg，-70℃保存的血浆冻融不应超过3次。

（2）检测步骤：

所有检测须采用经国家市场监督管理总局注册批准且在有效期内的试剂，严格按照试剂盒说明书操作。

（3）结果判定与报告

1）用于治疗效果和病程监测：

在各项质控品在控的前提下，检测值在试剂检测线性范围内报告实际检测值，高于检测上限报告“＞上限数值”，低于检测下限报告“＜下限数值”，无目的片段的有效扩增报告“未检测到目标”。

2）用于HIV-1感染的诊断：

在各项质控品在控的前提下，检测值＞5 000cps/mL（或IU/mL）报告检测值；检测值≤5 000cps/mL（或IU/mL），尽快再次严格按核酸检测的要求采样检测，检测值＞5 000cps/mL（或IU/mL），报告检测值，结果仍≤5 000cps/mL（或IU/mL），则需充分结合流行病学史、临床病史、CD4+T淋巴细胞计数和HIV-1抗体随访检测结果等进行综合判断。检测值低于检测限不能排除HIV-1感染（注：由于核酸定量检测方法获得的低病毒检测值可能是核酸污染所致的结果，根据国内外相关数据和报道，建议用5 000cps/mL作为判断结果的阈值，两次定量检测有助于准确判断结果）。诊断策略如图2-6所示。