第一章　病毒病

第一节　禽　病

一、禽流感

禽流感是由禽流感病毒引起的一种急性传染病，可引起禽类死亡，属于人畜共患病，根据其临床表现和致死率，可将其分为高致病性禽流感、低致病性禽流感和非致病性禽流感。低致病性禽流感可使禽类出现轻度呼吸道症状，食量减少，下痢，产蛋量下降，出现零星死亡。高致病性禽流感最为严重，通常无典型临床症状，发病急，体温升高，食欲废绝，伴有出血综合征，并随之死亡，死亡率高达100%，给养禽企业造成毁灭性的打击，我国将其列为一类动物疫病，世界动物卫生组织将其列为A类传染病。

（一）病毒特征

禽流感病毒（AIV），属于甲型流感病毒，RNA病毒的正黏病毒科，分为甲、乙、丙三个型，其中甲型流感病毒多发于禽类，一些甲型流感病毒也可感染猪、马、海豹等各种哺乳动物及人类，乙型和丙型流感病毒则分别见于海豹和猪的感染。根据禽流感病毒对鸡和火鸡的致病性的不同，分为高、中、低/非致病性三级。

病毒呈多形性，其中球形直径为80～120nm，有囊膜，基因组为分阶段单股复链RNA。依据其外模血凝素（H）和神经氨酸酶（N）蛋白抗原性的不同，可将其分为16个H亚型（H1～H16）和9个N亚型（N1～N9），其中H5和H7亚型毒株可导致高致病性禽流感的发生，引起人类、禽类、畜类共患急性传染病。禽流感病毒抗原性变异的频率很高，主要以抗原漂移和抗原转变的方式，抗原漂移可引起HA和/或NA的次要抗原变化，而抗原转变可引起HA和/或NA的主要抗原变化。抗原漂移：抗原性漂移可由编码HA和/或NA蛋白的基因发生点突变引起的，是在免疫群体中筛选变异体的反应，它可引起致病性更强病毒的出现。抗原性转变：抗原性转变是当细胞感染两种不同禽流感病毒时，病毒基因组的片段特性允许发生片段重组，从而引起突变。另外，禽流感病毒因其会随外界环境刺激（药物刺激、射线刺激等）及简单的基因结构不断发生变异使其能逃脱动物产生的特异性抗体，这样，原有的抗体即失去了作用，病毒可以使动物重新发病，因此，就目前的防疫和技术手段而言，禽流感病毒是消灭不了的。

禽流感病毒会侵害鸡呼吸系统和生殖系统，造成肉鸡生长缓慢，蛋鸡产蛋下降，侵害鸡群的生殖系统（卵巢和输卵管）后，造成卵泡停止发育或损伤，卵子被破坏变形，破裂掉入腹腔，造成卵黄性腹膜炎。感染鸡群可出现输卵管充血、水肿等病理变化，引起产蛋率的下降，产出畸形蛋沙壳蛋和软壳蛋，持续时间可长达1～2个月，引发严重的经济损失。康复鸡有一定比例（10%～30%）终身停产。病愈后很难恢复到原有水平。

（二）临床症状

高致病性禽流感往往突然暴发，鸡无任何临床症状而死亡，病程稍长的可见其精神萎靡，不食，羽毛松乱，头、翅膀下垂，鸡冠和肉髯呈暗紫色，头部水肿（图1-1），结膜肿胀发炎，鼻腔内有黏性分泌物，常摇头，呼吸困难。有些病例出现下痢和神经症状，抽搐，运动失调，瘫痪和半瘫痪，失明。潜伏期从几小时到数天，最长可达21天。表现为突然死亡，高死亡率，饲料和饮水消耗量及产蛋量急剧下降，脚鳞出血（图1-2）和神经紊乱。鸭鹅等水禽有明显神经和腹泻症状，可出现角膜炎症（图1-3），甚至失明。

低致病性禽流感又叫温和型禽流感，主要表现呼吸道症状，产蛋率下降，发病率高，但死亡率低，病程较长。感染后往往造成禽群的免疫力下降，对各种病原的抵抗力降低，常常易发生并发或继发感染。当这类毒株感染伴随有其他病原的感染时，死亡率变化范围较广（5%～97%），高死亡率主要出现在青年鸡、产蛋鸡或严重应激的鸡，损伤主要发生在呼吸道、生殖道、肾或胰腺。因此低致病性禽流感对养禽业的危害也是很严重的。

不同种类和日龄的家禽感染低致病性禽流感后有不同的表现：

鸡：初期表现体温升高，精神沉郁，叫声减小，缩颈，嗜睡，采食量减少或急骤下降，嗉囊空虚，排黄绿色稀便。呼吸困难，咳嗽，打喷嚏，张口呼吸。后期部分鸡只有神经症状，表现头颈向后仰，抽搐，运动失调，瘫痪等。产蛋鸡感染后，蛋壳质量变差、畸形蛋增多，会出现软壳蛋、无壳蛋、褪色蛋等。2～3天产蛋开始下降，7～14天产蛋可下降到5%～10%，严重的鸡可停止产蛋。持续1～5周产蛋开始上升，但恢复不到原来的水平。一般经1～2个月逐渐恢复到90%～70%的水平。种鸡还表现种蛋受精率下降20%～40%，并导致10%左右的死胚，苗雏弱雏率增加，10%～20%的雏鸡在1周内出现死亡。

鸭：鸭群和病鸭采食变化不大，有的鸭群采食量还增加。病鸭精神沉郁，离群呆立，羽毛无光泽、蓬松，脱羽，不愿下水，下水后鸭体吃水深，上岸后羽毛难以干燥。病鸭腹泻，个别鸭拉暗红色稀粪。病程稍长的鸭出现衰竭死亡。早期死亡的鸭只往往体况较好，多为体重大的，剖检其嗉囊和肌胃都有饲料，类似猝死症。病鸭群产蛋量下降，7天内产蛋率可由95%迅速下降到60%；60%产蛋率的鸭群发病后，产蛋率可下降到30%左右。产白壳蛋、沙壳蛋、畸形蛋，蛋壳变薄。康复后，产蛋率仅能恢复到75%左右。

（三）病理变化

病毒主要侵入呼吸道黏膜的上皮细胞，引起上皮细胞增生、坏死、黏膜局部充血、水肿和浅表溃疡等卡他性病变。4～5d后，基底细胞层病变可扩展到支气管、细支气管、肺泡和支气管周围组织，引起黏膜水肿、充血、淋巴细胞浸润，并伴有微血管栓塞、坏死、小动脉瘤形成和出血等，引发全身毒血症样反应。少数重症进行性肺炎除细支气管炎症变化外，可有肺泡壁水肿、纤维蛋白渗出，单核细胞浸润和透明膜形成，以及肺出血等，引起诸多并发症。其特征是角膜混浊，眼结膜出血、溃疡；翅膀、嗉囊部皮肤表面有红黑色斑块状出血等，还常见脚胫鳞片红褐色出血斑块，头部眼周围、耳和肉髯水肿，颈和胸部皮下有淡黄色胶冻样液体（图1-4）和充血；腺胃乳头轻度出血、腺胃和肌胃的交界处黏膜轻度出血（图1-5）；胰腺出血，胰腺表面有量的白色或淡黄色坏死点；口腔、肌胃角质膜下、十二指肠出血；胸部肌肉、脂肪、胸骨内面小点出血；心脏也有散在出血点；肝、脾、胃、肺常见有灰黄色坏死灶；心包有充血或积液，有些病例有纤维素样渗出物，心肌有灰白色坏死性条纹；蛋鸡或种鸡，卵泡充血、出血、萎缩，输卵管内可见乳白色分泌物或凝块，有的见卵泡破裂引起的卵黄性腹膜炎。

鸡低致性禽流感的主要剖检病变表现在以下三个方面。①呼吸系统：呼吸道尤其是鼻窦，典型特征是出现卡他性、纤维蛋白性、浆液纤维素性、黏脓性或纤维素性脓性的炎症。气管黏膜充血水肿，偶尔出血。②生殖系统病变：蛋鸡的卵巢炎症、卵泡出血、变性和坏死，输卵管水肿，浆液性、干酪样渗出，卵黄性腹膜炎。③消化系统病变：腺胃、肌胃出血，肠道出血及溃疡。

病死鸭解剖主要表现为：早期气管充血、出血严重，似红地毯状，支气管内有黄白色的干酪样渗出物。肝脏轻微肿大。后期解剖可见气管充血、出血严重，支气管有黄白色的干酪样物堵塞，肝脏有纤维素性渗出，心包液混浊，气囊混浊有干酪样物附着。胰脏肿大、出血，肠道黏膜充血、出血（图1-6）。输卵管黏膜充血、水肿。卵泡充血、出血。乳脂腺有干酪样坏死。

（四）流行病学特征

高致病性禽流感病毒主要通过空气进行传播，借助病毒表面的血凝素（H），与呼吸道黏膜上皮细胞表面的相应受体结合，吸附可宿主的呼吸道上皮细胞上。又借助病毒表面的神经氨酸酶（N）作用于核蛋白的受体，使病毒和上皮细胞的核蛋白结合，在核内组成RNA型可溶性抗原，并渗出至胞质周围，复制子代病毒，通过神经氨酸酶作用，以出芽方式排出上皮细胞。一个复制过程的周期为4～6h，排除的病毒扩散至附近细胞，产生炎性反应，临床上出现发热，肌肉痛和白细胞减低等全身毒血症样反应。禽流感病毒常从病禽的眼、鼻腔分泌物和粪便中排出，病毒受到了这些有机物的保护极大地增加了存活时间。此外，禽流感病毒可以在自然环境中，特别是凉爽和潮湿的环境中存活很长时间，粪便中病毒的传染性在4℃条件下可以保持长达30～50d，20℃为7d。

高致病性禽流感病毒与普通流感病毒相似，一年四季均可流行，但在冬季和春季容易流行，因此，禽流感病毒在低温条件下抵抗力较强。各种品种和不同日龄的禽类均可感染高致病性禽流感，发病急、传播快，其致死率可达100%。禽流感呈世界性分布，绝大多数呈隐性感染，不表现任何临诊症状；由H5及H7亚型所致时，常出现临诊症状甚至死亡。许多家禽、野禽和鸟类都对禽流感病毒敏感，在自然条件下，鸡、火鸡、鸭最易感，鹅次之。禽流感主要是横向传播，一般为接触性传染，禽类通过消化道和呼吸道感染。尚没有证据表明该病毒可垂直传播，但在感染蛋鸡所产蛋中可分离到禽流感病毒。哺乳动物如猪等也可传播本病。候鸟、观赏鸟类等携带病毒迁徙可能是禽流感世界性流行的主要原因。

低致病性禽流感主要以水平传播为主，即是指群体之间或个体之间以水平形式横向平行传播，如通过空气、粪便、饮料和饮水等传播，其中粪便是低致病性禽流感传播的主要渠道。低致病性禽的病因主要是外界病源侵入感染，例如一些野生鸟类携带低致病性禽流感的现象就很普通。低致病性禽流感具有疫病传播快、生产危害大的特点，多发于春季和秋冬交替季节，目前已是全球性的问题。

（五）预防及治疗

要预防禽流感的发生和大面积扩散，当禽流感发生时，养殖户应提高对禽流感的防范意识，加大对禽流感的预防控制。疫苗接种是目前最有效的预防措施，要定期对家禽进行禽流感疫苗的注射，对饲养环境进行清洁和消毒。由于本病血清亚型较多，不同亚型之间不能产生交叉免疫，对禽流感疫苗的选择要具有针对性，要选择合适的毒株、高保护力和高抗体的疫苗，要使用国家批准的疫苗接种。制定合理、科学的免疫程序，定期进行抗体测定，对抗体较低、离散度较高的禽群进行及时的补免补防。

（1）免疫接种　严格认真地做好禽流感的疫苗免疫，特别是春秋两季禽流感高发季节集中免疫，根据抗体检测结果，每隔3～4个月进行一次H5亚型、H7亚型和H9亚型禽流感的免疫接种，可以抵抗本血清型的流感病毒，抗体维持时间一般为10周以上，免疫密度要达到100%，免疫抗体合格率要达到70%以上。

（2）切实做好饲养管理　采取封闭式饲养，防止野鸟从门窗进入禽舍；防止水源和饲料被野禽粪便污染，定期对禽舍及周围环境周围进行消毒，加强带鸡消毒，定期消灭禽场内的有害昆虫及鼠类。提高禽群的抵抗力，尽量减少应激的发生，注意秋冬、冬春的季节变化，做好防寒保暖工作。

（3）对于出现死亡和产蛋率下降的鸡群可以使用提高免疫力的中草药配合敏感的抗菌药物用于治疗肠炎和输卵管炎，如并发呼吸道症状，再配合多西环素或泰乐菌素等，出现产蛋率下降时，饲料中添加维生素B12、亚硒酸钠、维生素E等。

发生低致病性禽流感时应采取“免疫为主，治疗、消毒、改善饲养管理和防止继发感染为辅”的综合措施。通过及时治疗，争取缩短病程，控制继发感染，使鸡群较快耐过，减轻损失。一般来说，所用药物应包括以下功效：抑制病毒增殖（须在发病早期用药）；增强机体免疫功能，使机体对感染的病毒尽快产生免疫力；退热，促使病鸡精神好转，尽快恢复正常采食；防止细菌性继发感染，阻止死亡，缓解呼吸道症状，保护生殖系统。前三项功效可考虑以中药制剂为主，抗菌以西药为主。具体方法如下：

（1）禽流感多价卵黄抗体或抗血清，雏鸡用量1～2ml，青年鸡和成年鸡2～3ml，肌内注射，每天1次，连用2d。

（2）中药与抗菌西药结合，如每羽成年鸡按板蓝根注射液（口服液）1～4ml，一次肌内注射/口服；阿莫西林按0.01%～0.02%浓度混饮或混饲，每天2次，连用3～5d。

（3）用金丝桃素（贯叶、连翘提取物），预防剂量为每吨饲料中添加 400g，连用7d；治疗剂量为每只鸡用50～60毫克，连用3～4d。

（六）实验室检测

依据标准：GB/T 18936—2003。

1.病毒分离与鉴定技术

（1）材料准备

1）病料的采集：死禽采集气管、脾、肺、肝、肾和脑组织样品，进行分别处理或者同时处理；活禽病料采集应包括气管或泄殖腔拭子，尤其是采集气管拭子更好；小珍禽用拭子采样容易造成损伤，可采集新鲜粪便。

2） 病料应放在含有抗生素的pH值应调至7.0～7.4的等渗磷酸盐缓冲液（PBS）内（无PBS可用25%～50%的甘油盐水）。抗生素的选择应视当地情况而定，组织和气管拭子悬液中应含有青霉素（2000IU/ml）、链霉素（2mg/ml）、庆大霉素（50μg/ml）和制霉菌素（1000IU/ml），但粪便和泄殖腔拭子，所有的抗生素应提高5倍，加入抗生素后pH值应调至7.0～7.4。在室温防治1～2h后，样品应尽快处理，没有条件的可在4℃存放几天，也可与低温条件下保存（－70℃贮存最好）。

3）病料的处理：将棉拭子充分捻动、拧干后弃去拭子：粪便、捻碎的组织用含抗生素的pH 7.0～7.4的等渗PBS溶液配成10～20g/100ml（g/ml）的悬液。样品经1000r/min离心10min，取上清液作为接种材料。

（2）病毒分离

1）样品接种：取处理好的样品，以0.2ml/胚的量经尿囊腔途径接种9～11日龄SPF鸡胚，每个样品接种5个胚，与35～37℃孵化箱内孵育，18h后每8h观察鸡胚死亡情况。

2）病毒收获：无菌收取18h以后的死胚以及96h仍存活鸡胚的鸡胚尿囊液，测血凝活性，阳性反应说明可能有正黏病毒科的流感病毒；若无血凝活性或血凝价很低，则用尿囊液继续传2代，若仍为阴性，则认为病毒分离阴性。

（3）病毒鉴定

1）A型流感病毒的特异性鉴定：样品接种鸡胚后，若鸡胚尿囊液具有血凝活性，可用具有血凝活性鸡胚的绒毛囊膜（CAM）制成抗原，与A型禽流感病毒标准阳性血清进行AGID试验，检测样品中是否含有A流感病毒。

① 抗原制备：从具有血凝活性的鸡胚中取出绒毛尿囊膜，用pH7.2的PBS冲洗后，将CAM用研磨器磨碎。磨碎的抗原反复冻融3～4次，以1000r/min后取上清，按终浓度为0.1%的量加入甲醛溶液。置37℃温箱灭活36h做灭活检验后即可作为AGID试验用抗原，用禽流感标准阳性血清进行特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线即可判定样品中标准阳性血清进行特异性鉴定，若被检样品与标准阳性血清之间出现清晰的沉淀线，即可判定样品中含有A型禽流感病毒。

② AGID试验方法：按“3.琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验”中的方法进行。

2）血凝素亚型鉴定：当鸡胚尿囊液具有血凝活性时，首先应排除血凝活性是否由新城疫、减蛋综合征等病毒引起，同时要注意是否有禽流感病毒与其他病毒混合感染。鸡胚尿囊液具有血凝活性或证明含有A型流感病毒存活后，采用HA～HI试验方法，用禽流感病毒15种血凝素（H1～H15）亚型分型血清对样品进行病毒亚型鉴定。血凝素亚型鉴定要求有全套的禽流感病毒血凝素分型血清，一般在国家指定的实验室进行。

（4）致病性测定

禽流感病毒致病性测定应在具有高度生物安全性的实验室中进行，有以下两种方法，任选其一。

1）静脉接种致病指数（IVPI）测定法

① 试验鸡：6周龄SPF鸡，10只。

② 接种材料：感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。

③ 接种方法：将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1∶10稀释，以0.1ml/羽的剂量翅静脉接种。

④ 每日观察每只鸡的发病及死亡情况，连续观察10d，计算IVPI值。

⑤ 判定标准：当IVPI值大于1.2时，判定此份离株为高致病性禽流感（HPAI）病毒株。

2）致死比例法测定

① 试验鸡：4～8周龄SPF鸡，8只。

② 接种材料：感染鸡胚的尿囊液，血凝价在4log2以上，未混有任何细菌和其他病毒。

③ 接种方法：将感染鸡胚尿囊液用生理盐水1∶10稀释，以0.2ml/羽的剂量翅静脉接种。每日观察鸡的死亡情况，连续观察10d。

④ 判定方法

a.接种10d内能导致6～8只鸡死亡，判定该毒株为高致病性禽流感毒株。

b.分离物能使1～5只鸡致死，但病毒不是H5或H7亚型，则应进行以下试验：将病毒接种于细胞培养物上，观察其胰蛋白酶缺乏时是否引起细胞病变或形成蚀斑。如果病毒不能在细胞上生长，则分离物应被考虑为非高致病性禽流感病毒。

c.对低致病性的所有H5或H7毒株和其他病毒，在缺乏胰蛋白酶的细胞上能够生长时，则应进行与血凝素有关的肽链的氨基酸序列分析，如果分析结果同其他高致病性禽流感病毒相似，这种被检验的分离物应被考虑为高致病性禽流感病毒。

2.血凝（HA）与血凝抑制（HI）试验

（1）原理　禽流感病毒表面的血凝素能与豚鼠和鸡的红细胞表面的血凝素受体结合，引起红细胞凝集。

（2）适用范围　主要用于检测禽流感免疫禽血清抗体效价。

（3）试验器材和试剂

1）96孔110°V形血凝板

2）微量移液器（50μl、25μl）带滴头

3）微量振荡器

4）禽流感病毒血凝素分型抗原和标准分型阳性血清

5）阿氏（Alsevers）液、1%鸡红细胞悬液，配制方法见附录A

6）pH7.2 0.01mol/L磷酸盐缓冲液（PBS）

（4）HA试验方法

1）在微量反应板的1～12孔均加入0.025ml PBS，换滴头。

2）吸取0.025ml病毒悬液加入第1孔，混匀。

3）从第1孔吸取0.025ml病毒液加入第2孔，混匀后吸取0.025ml加入第3孔，如此进行对倍稀释至第11孔，从第11孔吸取0.025ml弃之，换滴头。

4）每孔再加入0.025ml PBS。

5）每孔均加入0.025ml 体积分数为1%鸡红细胞悬液（将鸡红细胞悬液充分摇匀后加入）。

6）振荡混匀，在室温（20～25℃）下静置40min后观察结果（如果环境温度太高，可置4℃环境下反应1h）。对照孔红细胞将呈明显的纽扣状沉到孔底。

7）结果判定：将板倾斜，观察血凝板，判读结果（见表1-1）。

能使红细胞完全凝集（100%凝集，++++）的抗原最高稀释度为该抗原的血凝效价，此效价为1个血凝单位（HAU）。注意对照孔应呈现完全不凝集（－），否则此次检验无效。

（5）血凝抑制（HI）试验方法

1）根据（4）试验结果配制4HAU的病毒抗原。以完全血凝的病毒最高稀释倍数作为终点，终点稀释倍数除以4即为含4HAU的抗原的稀释倍数。例如，如果血凝的终点滴度为1∶256，则4HAU抗原的稀释倍数应是1∶64（256除以4）。

2）在微量反应板的1～11孔加入0.025ml PBS，第12孔加入0.05ml PBS。

3）吸取0.025ml血清加入第1孔内，充分混匀后吸0.025ml于第2孔，依次对倍稀释至第10孔，从第10孔吸取0.025ml弃去。

4）1～11孔均加入含4HAU混匀的病毒抗原液0.025ml，室温（约20℃）静置至少30min。

5）每孔加入0.025ml体积分数为1%的鸡红细胞悬液混匀，振荡混匀，静置约40min（室温约20℃，若环境温度太高可置4℃条件下进行1h），对照红细胞将呈现纽扣状沉于孔底。

6）结果判定

以完全抑制4个HAU抗原的血清最高稀释倍数作为HI滴度。

只有阴性对照孔血清滴度不大于2log2，阳性对照孔血清误差不超过1个滴度，试验结果才有效。HI价小于或等于3log2判定HI试验阴性；HI价等于4log2为可疑，需重复试验；HI价大于或等于5log2为阳性。

3.琼脂凝胶免疫扩散（AGID）试验

（1）材料准备

1）硫柳汞溶液、pH7.2、0.01mol/PBS溶液，配制方法见附录B。

2）琼脂板：制备方法见附录C。

3）禽流感琼脂凝胶免疫扩散抗原、标准阴性和阳性血清。

（2）操作方法

1）打孔：在制备的琼脂板上按7孔一组的梅花形打孔（中间1孔，周围6孔），孔径5mm，孔距2～5mm。将孔中的琼脂用8号针头斜面向上从右侧边缘插入，轻轻向左侧方向将琼脂挑出，勿伤边缘或使琼脂层脱离皿底。

2）封底：用酒精灯清烤平皿底部至琼脂刚刚要融化为止，封闭孔的底部，以防侧漏。

3）加样：用微量移液器或带有6～7号针头的0.25ml注射器，吸取抗原悬液滴入中间孔，标准阳性血清分别加入外周的1和4孔中，被检血清按编号顺序分别加入另外4个外周孔。每孔均以加满不溢出为度，每加一个样品应换一个滴头。

4）作用：加样完毕后，静置5～10min，然后将平皿轻轻倒置，放入湿盒内，37℃温箱中作用，分别在24h、48h和72h观察并记录结果。

（3）结果判定

1）判定标准

将琼脂板置日光灯或侧强光下观察，若标准阳性血清与抗原之间出现一条清晰的白色沉淀线，则试验成立。

2）判定标准

① 若被检血清孔与中心抗原孔之间出现清晰致密的沉淀线，且该线与抗原与标准阳性血清之间沉淀线的末端相吻合，则被检血清判为阳性。

② 被检血清与中心孔之间虽不出现沉淀线，但标准阳性血清的沉淀线一端向被检血清孔内侧弯曲，则此孔的被检样品判为弱阳性（凡弱阳性者应重复试验，仍为弱阳性者判为阳性）。

③ 若被检血清孔与中心抗原孔之间不出现沉淀线，且标准阳性血清沉淀线直向被检血清孔，则被检血清判为阳性。

④ 被检血清孔与中心抗原孔之间沉淀线粗而混浊或标准阳性血清与抗原孔之间的沉淀线交叉并直伸，被检血清孔为非特异反应，应重做，若仍出现非特异性反应则判为阴性。

4.间接酶联免疫吸附试验（间接ELISA）

（1）材料准备

1）酶标板、加样器（带滴头）、酶标测定仪。

2）使用溶液的配制：方法见附录D。

3）间接ELISA抗原，间接ELISA酶标抗体。

4）抗原包被板制备：方法见附录E。

（2）操作步骤

1）样品制备：将被检血清用稀释液做1∶400稀释。

2）加样：取出抗原包被板，倒掉孔内包被液，用洗液洗3次。除A1、B1、C1和D1孔不加样品，留做空白调零，阴性血清和阳性血清做对照各占1孔外，其余孔加1∶400稀释的被检血清，每孔100μl，将加样位置做好记录，将反应板盖好盖子后置37℃环境下作用30min。

3）洗涤：倒掉孔内液体，在吸水纸上空干，每孔加满洗液，静置1～2min后倒掉，空干，再重复洗2次。

4）加酶标抗体：除A1、B1、C1和D1孔外，其余每孔加酶标抗体液100μl，盖好盖子后置37℃环境下作用30min。

5）洗涤：洗涤方法同3）。

6）加底物：加底物使用液，每孔90μl，置室温避光显色2～3min。

7）终止：加终止液，每孔90μl，使其终止反应。

（3）结果判定　用酶标仪测定每个孔在490nm波长的光密度值（即OD值），OD≥0.2者判为阳性，0.18≤OD<0.2需重复测试1次，若仍在此范围判为阳性，OD<0.18者判定为阴性。

5.禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法

（1）依据标准：GB/T 19438.1—2004。

（2）缩略语

荧光RT-PCR：荧光反转录-聚合酶链式反应。

Ct值：每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数。

RNA：核糖核酸。

DEPC：焦碳酸乙二脂

PBS：磷酸盐缓冲盐水（配方见附录F）

Taq酶：Taq DNA聚合酶。

（3）实验原理　禽流感病毒各亚型均属A型流感病毒，根据A型流感病毒共有基因特定的序列，合成一对特异性引物和一条特异性的荧光双标记探针。该探针与禽流感病毒特有的共同基因特异性结合，结合部位位于引物结合区域内。探针的5’端和3’端分别标记不同的荧光素，如5’端标记FAM荧光素，它发出的荧光能够被检测仪器接受，成为报告荧光基团（用R表示），3’端一般标记TAMRA荧光素，它在近距离内能吸收5’端报告荧光基团发出的荧光信号，成为淬灭荧光基团（用Q表示）。

当PCR反应在退火阶段时，一对引物和一条探针同时与目的基因片段结合，此时探针上的R基团发出的荧光信号被Q基团所吸收，仪器检测不到R所发出的荧光信号；当PCR反应在延伸阶段时，Taq酶在引物的引导下，以四种核苷酸为底物，根据碱基配对的原则，沿着模板链形成新链；当链的延伸进行到探针结合部位，受到探针的阻碍而无法继续，此时的Taq酶发挥它的5’→3’外切核酸酶的功能，将探针水解成单核苷酸，消除阻碍，与此同时在探针上的R基团游离出来，R所发出的荧光再不为Q所吸收而被检测仪所接收；在Taq酶的作用下继续延伸过程合成完整的新链，R和Q基团均游离于溶液中，仪器可继续被检测到R所发出的荧光信号。

（4）材料与试剂

① 仪器与器材

荧光RT-PCR检测仪

高速台式离心机（离心速度12000r/min以上）

台式离心机（离心速度3000r/min）

混匀器

冰箱（2～8℃和－20℃两种）

微量可调移液器（10μl、100μl、1000μl）及配套带滤芯吸头

Eppendorf管（1.5ml）

② 试剂

除特别说明外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器（用DEPC水处理后高压灭菌）分装。

氯仿：－20℃预冷；

PBS：121℃±2℃，15min高压灭菌冷却后，无菌条件下加入青霉素、链霉素各10000IU/ml；

75%乙醇：用新开启的无水乙醇和DEPC水（符合GB 6682要求）配制，－20℃预冷；

禽流感病毒通用型荧光RT-PCR检测试剂盒：组成、功能及使用注意事项见附录G。

（5）抽样

① 采样工具

② 样品采样

a.活禽

取咽喉拭子和泄殖腔拭子，采集方法如下：

——取咽喉拭子时将拭子深入喉头口及上颚裂来回刮3～5次取咽喉分泌液；

——取泄殖腔拭子时将拭子深入泄殖腔转一圈并沾取少量粪便；

——将拭子一并放入盛有1.0ml PBS的1.5ml Eppendorf管中，加盖、编号。

b.肌肉或组织脏器：待检样品装入一次性塑料袋或其他灭菌容器，编号，送实验室。

c.血清、血浆：用无菌注射器直接吸取至无菌Eppendorf管中，编号备用。

③ 样品贮运：样品采集后，放入密闭的塑料袋内（一个采样点的样品，放一个塑料袋），于保温箱中加冰、密封、送实验室。

④ 样品制备

咽喉、泄殖腔拭子：样品在混合器上充分混合后，用高压灭菌镊子将拭子中的液体挤出，室温放置30min，取上清液转入无菌的1.5ml Eppendorf管中，编号备用。

⑤ 样本存放。制备的样本在2～8℃条件下保存应不超过24h，若需长期保存应置－70℃以下，但应避免反复冻融（冻融不超过3次）。

（6）操作方法

① 实验室标准化设置与管理。禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法的实验室规范（见附录H）。

② 样本的处理。在样本制备区进行。

a.取n个灭菌的1.5ml Eppendorf管，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和（阳性对照、阴性对照在试剂盒中以标出），编号。

b.每管加入600μl裂解液，分别加入被检样本、阴性对照、阳性对照各200μl，一份样本换用一个吸头，再加入200μl氯仿，混匀器上振荡混匀5s（不能过于强烈，以免产生乳化层，也可以用手颠倒混匀）。于4℃、12000r/min离心15min。

c.取与a.相同数量灭菌的1.5ml Eppendorf管，加入500μl异丙醇（－20℃预冷），做标记。吸取本标准b.各管中的上清液转移至相应的管中，上清液应至少吸取500μl，不能吸出中间层，颠倒混匀。

d.于4℃、12000r/min离心15min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，放置于吸水纸上，蘸干液体（不同样品须在吸水纸不同地方蘸干）；加入600μl 75%乙醇，颠倒洗涤。

e.于4℃、12000r/min离心10min（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），小心倒去上清，放置于吸水纸上，蘸干液体（不同样品须在吸水纸不同地方蘸干）。

f.4000r/min离心10s（Eppendorf管开口保持朝离心机转轴方向放置），将管壁上的残余液体甩到管底部，小心倒去上清，用微量加样器将其吸干，一份样本换用一个吸头，吸头不要碰到有沉淀一面，室温干燥3min，不能过于干燥，以免RNA不溶。

g.加入11μl DEPC水，轻轻混匀，溶解管壁上的RNA，2000r/min离心5s，冰上保存备用。提取的RNA须在2h内进行PCR扩增；若需长期保存须放置－70℃冰箱。

③ 检测

a.扩增试剂准备：在反应混合物制备区进行。

从试剂盒中取出相应的荧光RT-PCR反应液、Taq酶，在室温下融化后，2000r/min离心5s。设所需荧光RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照与阴性对照的和，每个样品测试反应体系配制见表1-2：

根据测试样品的数量计算好各试剂的使用量，加入适当的体积中，向其中加入0.25×n颗RT-PCR反转录酶颗粒，充分混合均匀，向每个荧光RT-PCR管中各分装15μl，转移至样本处理区。

b.加样：在样品处理区进行。

在各设定的荧光RT-PCR管中分别加入上述样本处理步骤②、g中制备的RNA溶液各10μl，盖紧管盖，500r/min离心30s。

c.荧光RT-PCR检测：在检测区进行。

将b.中离心后的PCR管放入荧光RT-PCR检测仪内，记录样本摆放顺序。

循环条件设置。

第一阶段，反转录42℃/30min；

第二阶段，预变性92℃/3min；

第三阶段，92℃/10s，45℃/30s，72℃/1min，5个循环；

第四阶段，92℃/10s，60℃/30s，40个循环，在第四阶段每个循环的退火延伸时收集荧光。试验检测结束后，根据收集的荧光曲线Ct值判定结果。

（7）结果判定

① 结果分析条件设定：直接读取检测结果。阈值设定原则根据仪器噪声情况进行调整，以阈值线刚好超过正常阴性样品扩增曲线的最高点为准。

② 质控标准

a.阴性对照无Ct值并且无扩增曲线。

b.阳性对照的Ct值应<28.0，并出现典型的扩增曲线。否则，此次试验视为无效。

③ 结果描述及判定

a.阴性：无Ct值并且无扩增曲线，表示样品中无禽流感病毒。

b.阳性：Ct值≤30，且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在禽流感病毒。

c.有效原则：Ct值>30的样本建议重做。重做结果无Ct值者为阴性，否则为阳性。

附录A

（规范性附录）

HA和HI试验用溶液的配制

A.1　阿氏（Alsevers）液配制

葡萄糖　　　　　 　　　　　　　　2.05g

柠檬酸钠　　　　　　　　　　　　0.8g

柠檬酸　　　　　　　　　　　　　0.055g

氯化钠　　　　　　　　　　　　　0.42g

加蒸馏水至100ml，散热溶解后调pH值至6.1，69kPa 15min高压灭菌，4℃保存备用。

A.2　1%鸡红细胞悬液制备

采集至少3只SPF公鸡或无禽流感和新城疫等抗体的健康公鸡的血液与等体积的阿氏液混合，用pH7.2 0.01mol/L PBS液洗涤3次，每次均以1000r/min离心10min，洗涤后用PBS配成体积分数为1%红细胞悬液，4℃保存备用。

附录B

（规范性附录）

AGP试验用溶液的配制

B.1　1%硫柳汞溶液的配制

硫柳汞　　　　　　　　　　　　　1.0g

加蒸馏水至100ml

溶解后，置100ml瓶中盖好塞子存放备用。

B.2　pH7.2、0.01mol/L PBS的配制

（a）配制25×PB：称重2.74g磷酸氢二钠和0.79g磷酸二氢钠加蒸馏水至100ml。

（b）配制1×PBS：量取40ml 25×PBS，加入8.5g氯化钠，加蒸馏水至1000ml。

（c）用氢氧化钠或盐酸调pH至7.2。

（d）灭菌或过滤。

（e）PBS一经使用，于4℃保存不超过3周。

附录C

（规范性附录）

琼脂板的制备

称量琼脂糖1.0g，加入100ml的pH7.2、0.01mol/L PBS液中在水浴中煮沸充分融化，加入8g氯化钠，充分溶解后加入1%硫柳汞溶液1ml。冷至45～50℃时，将洁净干热灭菌直径为90mm的平皿置于平台上，每个平皿加入18～20ml，加盖待凝固后，把平皿倒置以防水分蒸发，放普通冰箱中保存备用（时间不超过2周）。

附录D

（规范性附录）

高致病性禽流感间接ELISA使用溶液的配制

D.1　碳酸盐缓冲液（0.05mol/L、pH9.6，CBS）

碳酸钠　　　　　　　　　　　　　　　1.59g

碳酸氢钠　　　　　　　　　　　　　　2.93g

用双蒸水溶解至1000ml，于4℃保存，不超过1个月。

D.2　磷酸盐缓冲液（0.01mol/L、pH7.4，PBS）

氯化钠　　　　　　　　　　　　　　　8g

磷酸二氢钠　　　　　　　　　　　　　0.2g

磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）　　　　2.9g

氯化钾　　　　　　　　　　　　　　　0.2g

加蒸馏水至1000ml

D.3　洗液（含0.05% 吐温-20的0.01mol/L、pH7.4的PBS即PBST）

吐温-20 　　　　　　　　　　　　　　0.5ml

加0.01mol/L、pH7.4的PBS至1000ml

D.4　封闭液（含0.5%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA）　　　　　　　　0.5g

加洗液至100ml

4℃存放，避光。

D.5　稀释液（含1%BSA的PBST）

牛血清白蛋白（BSA）　　　　　　　　0.1g

加洗液至100ml

4℃存放，避光。

D.6　间接ELISA底物缓冲液（磷酸氢二钠-柠檬酸，pH5.4）

0.2mol/L磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）　　　　26.7ml

0.1mol/L柠檬酸　　　　　　　　　　　　 　　　24.3ml

双蒸水　　　　　　　　　　　　　　　　　　　49ml

准确称量40mg邻苯二胺（OPD），溶解后置暗处保存，临用前加入30%过氧化氢150μl。

D.7　三羟甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）缓冲液（0.05mol/L，pH7.6）

0.1mol/L Tris　　　　　　　　　　　250ml

0.1mol/L盐酸　　　　　　　  　　　192.5ml

双蒸水　　　　　　　　　　　  　　57.5ml

D.8　间接ELISA终止液

浓硫酸　　　                                     　11.1ml

蒸馏水　　　                                     　88.9ml

附录E

（规范性附录）

高致病性禽流感间接ELISA抗原包被板制备

抗原包被板也称诊断板，将高致病性禽流感病毒抗原用0.05mol/L，pH9.6碳酸盐缓冲液稀释成3μg/ml（全病毒抗原）或6μg/ml（重组核蛋白抗原），包被40孔聚苯乙烯微量板，每孔100μl，置4℃冰箱过夜，用洗液洗涤3次，用封闭液于37℃湿盒内封闭60min，用洗涤液洗涤3次，干燥后即为诊断板，置4℃冰箱备用。

附录F

（规范性附录）

磷酸盐缓冲盐水配方

以下所用试剂均为分析纯。

F.1　A液

0.2mol/L磷酸二氢钠水溶液

NaH2PO4·H2O 27.6g，溶于蒸馏水，最后稀释至1000ml。

F.2　B液

0.2mol/L磷酸氢二钠水溶液

Na2HPO4·7H2O 53.6g（或Na2HPO4·2H2O 71.6g或Na2HPO4·2H2O 35.6g），加蒸馏水溶解，最后稀释至1000ml。

F.3　0.01mol/L、pH7.2磷酸盐缓冲盐水的配制

0.2mol/L　A液　　　               　14ml

0.2mol/L　B液　　                　　36ml

加NaCl 　　                             　　8.5g

用蒸馏水稀释至1000ml

附录G

（资料性附录）

试剂盒的组成

G.1　试剂盒组成

每个试剂盒可做48个检测，包括以下成分：

裂解液　　　　　　　　　　　　　　　   　           　　　30ml×1盒

DEPC水　　　　　　　　　　　　　　　　            　   　1ml×1管

RT-PCR反应液（内含禽流感病毒的引物、探针）        750μl×1管

RT-PCR酶　　　　　　　　　　　　　　　　　            　1颗/管×12管

Taq酶　　　　　　　　　　　　　　　　　　　             　12μl×1管

阴性对照　　　　　　　　　　　　　　　　                   　1ml×1管

阳性对照（非感染性体外转录RNA）　　　　  　             　1ml×1管

G.2　说明

（1）裂解液的主要成分为异硫氰酸胍和酚，为RNA提取试剂，外观为红色液体，于4℃保存。

（2）DEPC水，是用1%DEPC处理后的去离子水，用于溶解RNA。

（3）RT-PCR反应液中含有特异性引物、探针及各种离子。

G.3　功能

试剂盒可用于禽类相关样品（包括肌肉组织、脏器、咽喉拭子、泄殖腔拭子、血清或血浆等）中禽流感病毒的检测。

G.4　使用时的注意事项

（1）在检测过程中，必须严防不同样品间的交叉感染。

（2）反应液分装时应避免产生气泡，上机前检查各反应管是否盖紧，以免荧光物质泄漏污染仪器。

RT-PCR酶颗粒极易吸潮失活，必须在室温条件下置于干燥器内保存，使用时取出所需数量，剩余部分立即放回干燥器内。

附录H

（规范性附录）

禽流感病毒通用荧光RT-PCR检测方法的实验室规范

H.1　实验室设置要求

实验室设置要求如下：

——实验室分为三个相对独立的工作区域：样本制备区、反应混合物制备区和检测区；

——工作区域须有明确标记，避免不同工作区域内的设备、物品混用；

——每一区域须有专用的仪器设备；

——整个实验过程中均须使用无RNA酶的一次性耗材，用到的玻璃器皿使用前须250℃干烤4h以上，以彻底去除RNA酶；

——各区域的仪器设备须有明确标记，以避免设备物品从各自的区域内移出，造成不同的工作区域间设备物品发生混淆；

——进去各个工作区域严格遵循单一方向顺序，即只能从样本制备区、扩增反应混合物配制区至检测区；

——在不同的工作区域内使用不同颜色或有明显区别标志的工作服，以便于鉴别，离开工作区时，不得将各区特定的工作服带出；

——实验室清洁时应按样本制备区、扩增反应混合物制备区至检测区的顺序进行；

——不同的试验区域应有其各自的清洁用具以防止交叉污染。

H.2　工作区域仪器设备配置

（1）样本制备区　样本制备区需配置如下仪器设备：

——2～8℃冰箱；

——－20℃冰箱；

——高速台式冷冻离心机（4℃，12000r/min）；

——混匀器；

——微量加样器（0.5～10μl，5～20μl，20～200μl，200～1000μl）；

——可移动紫外灯（进工作台面）。

（2）反应混合物配制区　反应混合物制备区需配置如下仪器设备：

——2～8℃冰箱；

——－20℃冰箱；

——高速台式冷冻离心机（3000r/min）；

——混匀器；

——微量加样器（0.5～10μl，5～20μl，20～200μl，200～1000μl）；

——可移动紫外灯（进工作台面）。

（3）检测区　检测区需配置如下仪器设备：

——荧光PCR仪（配计算机）；

——移动紫外灯；

——打印机。

H.3　各工作区域功能及注意事项

（1）样本制备区　样本制备区的功能及注意事项如下；

——标本的保存，核酸提取、贮存及其加入至扩增反应管在样本制备区进行；

——避免在本区内不必要的走动。可在本区内设立正压条件以避免临近区的气溶胶进入本区造成污染。为避免样本之间的交叉污染，加入待测核酸后，必须立即盖严含反应混合液的反应管；

——用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内（例如含次氯酸钠溶液）。实验室桌椅表面每次工作后都要清洁，实验材料（原始样本、提取过程样本与试剂的混合液等）如出现外溅，必须清洁处理并作出记录；

——对实验台适当的紫外照射（254nm波长，与工作台面近距离）适合于灭活去污染。工作后通过移动紫外线灯管来确保对实验台面的充分照射。

（2）反应混合物配制区　反应混合物配制区功能及注意事项如下：

——试剂的分装盒反应混合液的制备在本区进行；

——用于标本制备的试剂应直接运送至反应混合物配制区，不能经过检测区，在打开含有反应混合液的离心管或试管前，应将其快速离心数秒；

——在整个本区的实验操作过程中，操作者必须戴手套，并经常更换，工作结束后必须立即对工作区进行清洁。在本区的实验台表面应可耐受诸如次氯酸钠等化学物质的消毒清洁作用。实验台表面用可移动紫外灯（254nm波长）进行照射。

（3）检测区　检测区功能及注意事项如下：

——RT-PCR扩增及扩增片段的分析在本区内进行；

——本区注意避免通过本区的物品及工作服将扩增产物带出。为避免气溶胶所致的污染，应尽量减少在本区内的走动；

——完成操作及每天工作后都必须对实验台面进行清洁和消毒，紫外照射方法与前面区域相同。如有溶液溅出，必须处理并作出记录。本区的清洁消毒和紫外照射方法同前面区域。