四、绵羊痘和山羊痘

绵羊痘和山羊痘是由绵羊痘病毒和山羊痘病毒引起的绵羊和山羊的一种急性、热性传染病，是OIE规定的A类动物疫病，也是我国划定的一类动物疫病。

绵羊痘又名绵羊天花，是各种家畜痘病中危害最为严重的一种热性、接触性传染病。其特征是无毛或少毛部位皮肤和黏膜上发生特异的痘疹，可见到典型的斑疹、丘疹、水泡、脓疱和结痂、脱落等病理过程。该病在非洲的赤道以北地区、中东、土耳其、伊朗、阿富汗、巴基斯坦、印度及尼泊尔等地区呈地方性流行，1984年以后还流行于孟加拉国。现由于引种频繁等原因我国也有该病发生。

（一）病毒特征

病原是绵羊痘病毒和山羊痘病毒，属于痘病毒科羊痘病毒属的成员。绵羊痘病毒（Sheep pox virus）为双股DNA病毒，病毒粒子呈砖形或椭圆形，大小为115～194nm，较其他动物痘病毒稍小而细长。病毒主要存在于病羊皮肤、黏膜的丘疹、脓疱以及痂皮内，鼻分泌物、发热期血液内也有病毒存在。

痘病毒对皮肤和黏膜上皮细胞具有特殊的亲和力。病毒侵入机体后，先在网状内皮系统增殖，后进入血液（病毒血症），扩散全身，在皮肤和黏膜的上皮细胞内繁殖，引起一系列的炎症过程而发生特异性的痘疹。

病毒对热、直射阳光、碱和多数常用消毒药均较敏感，如58℃ 5min或37℃ 24h即可杀死病毒。但对寒冷和干燥的抵抗力较强，冻干至少可保存3个月以上；在痂皮中痘病毒能耐受干燥，自然环境中能存活6～8周，在动物毛中保持活力2个月。

病毒可在绵羊、山羊、犊牛等睾丸细胞和肾细胞以及幼仓鼠肾细胞内增殖，并产生细胞病变；也可经绒毛尿囊膜途径接种于发育的鸡胚内增殖。通常可于增殖细胞内产生包涵体。

（二）临床症状

绵羊痘潜伏期平均为6～8d，典型病羊体温升高达41～42℃，食欲减少，精神不振，结膜潮红，有浆液、黏液或脓性分泌物从鼻孔流出，呼吸和脉搏增速，经1～4d出现痘疹。

痘疹多发生于皮肤无毛或少毛部位，如眼周围、唇、鼻、乳房、外生殖器、四肢内侧和尾内侧。开始为红斑，1～2d后形成丘疹，突出皮肤表面，随后丘疹逐渐扩大，变成灰白色或淡红色、半球状的隆起结节。结节在几天之内变成水泡，水泡内容物起初呈浆液性，后变成脓性，如果无继发感染则在几天内干燥成棕色痂块，痂块脱落后形成红斑，随着时间的推移红色逐渐变淡。

非典型病例不呈现上述典型症状或经过，仅出现体温升高和黏膜卡他性炎症，不出现或仅出现少量痘疹，或仅出现硬结块，在几天内干燥后脱落，不形成水泡和脓疱，此为良性经过，即所谓的顿挫型。有的病例见痘疹内出血，呈黑色痘。还有的病例痘疱发生化脓和坏疽，形成很深的溃疡，发出恶臭。常为恶性经过，病死率达20%～50%。

山羊痘的临诊症状和剖检病变与绵羊相似，其特征是发热，有黏液性、脓性鼻漏，在皮肤和黏膜上形成痘疹。在诊断时注意与羊的传染性脓疱鉴别，后者发生于绵羊和山羊，主要在口唇和鼻周围皮肤上形成水泡、脓疱，后结成厚而硬的痂，一般无全身反应。

（三）病理变化

特征性病变是在咽喉、气管、肺、肝和前胃或第四胃黏膜上出现痘疹，有大小不等的圆形或半球形坚实的结节，单个或融合存在，有的病例还形成糜烂或溃疡。咽和支气管黏膜亦常有痘疹，在肺见有干酪样结节和卡他性肺炎区，肠道黏膜少有痘疹变化。此外，常见细菌性败血症变化，如肝脂肪变性、心肌变性、淋巴结急性肿胀等。病羊常死于继发感染。

（四）流行病学特征

易感动物：在自然情况下，绵羊痘病毒只感染绵羊，不传染给山羊和其他家畜；山羊痘病毒感染山羊，少数毒株则可感染绵羊，并引起绵羊和山羊的恶性痘病。不同品种、性别、年龄的绵羊都有易感性，以细毛羊最为易感；羔羊比成年羊易感，病死率亦高。妊娠母羊易引起流产，因此在产前流行羊痘，可导致很大损失。但本土动物的发病率和病死率较低，主要感染从外地引进的绵羊新品种。

传染源：主要是病羊和带毒羊。病毒由本病病羊分泌物、排泄物和痂皮排出。

传播途径：主要途径为皮肤的伤口，在流行时可通过呼吸道传染，也可由厩蝇等吸血昆虫叮咬而感染。饲养管理人员、护理用具、皮毛、饲料、垫草、外寄生虫等是传播的媒介。

流行因素及形式：本病多发生于冬末春初，呈地方性流行。气候严寒、雨雪、霜冻、草缺乏和饲养管理不良等因素都可促使本病发生和病情加重。

（五）预防及治疗

预防措施：平时加强饲养管理，抓好秋膘，特别是冬春季适当补饲，注意防寒过冬。在绵羊痘常发地区的羊群，每年定期预防接种；受威胁的羊群均可用羊痘鸡胚化弱毒疫苗进行紧急接种，注射后4～6d产生可靠的免疫力，免疫期可持续1年。

扑灭措施：当发现病例时，立刻按照《中华人民共和国动物防疫法》的规定采取紧急、强制性的控制和扑灭措施。封锁疫区，对病羊隔离、扑杀，并作无害化处理，彻底消毒被病畜污染的环境。

治疗措施：本病尚无特效药，常采取对症治疗等综合性措施。发生痘疹后，局部可用0.1%高锰酸钾溶液洗涤，擦干后涂抹紫药水或碘甘油等。康复羊血清有一定的防治作用。预防量：成年羊每只5～10ml，小羊2.5～5ml；治疗量加倍，皮下注射。若已进入脓疱期则加大剂量。如用免疫血清早期治疗，效果更好。抗菌药物对本病无效，但可防止并发感染，可根据实际情况合理应用。

（六）实验室检测

绵羊痘和山羊痘诊断技术

依据标准：NY/T 576—2015。

实验室诊断技术

（1）样品采集　取活体或剖检羊的皮肤丘疹、肺部病变组织、淋巴结用于病毒分离和抗原检测；病料采集时间为临床症状出现后1周之内。采集病毒血症期间的组织进行病理组织学检查，病料为病变及病变周围组织，采集后迅速置于10倍体积的10%福尔马林溶液中。经颈静脉无菌采集血液，分离血清，置于－20℃保存，用于血清学检测。

（2）样品运输　福尔马林浸润的组织在运输时无特殊要求，用于病毒分离和抗原检测的样品应置于4℃或－20℃保存。如果样品在无冷藏条件下需要运送到较远的地方，应将样品置于含10%甘油的 Hank’s液中，用于血清学检测的样品，应置于加冰的冷藏箱内运输。

（3）病原鉴定

1）病毒分离

① 材料。MEM培养液（配制方法见附录A）、待检组织、绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B）、胎牛血清细胞培养瓶。

② 方法

a.样品制备：取待检组织，无菌剪碎，用组织匀浆器研磨；按1∶10的比例加入MEM培养液制备组织悬液，4℃过夜；1500r/min离心10min，取上清备用。

b.接种：取25cm2细胞培养瓶，待绵羊羔睾丸细胞形成90%单层后，接种1ml病料上清液，置37℃吸附1h。弃去瓶内液体，补足细胞维持液，置37℃、5%CO2条件下培养。同时，设立正常细胞对照1瓶。

c.培养及观察：每日观察细胞培养物是否出现CPE，持续培养14d，在培养期间可适时更换MEM培养液。如果14d仍未见CPE，将细胞培养物反复冻融3次，取上清液继续接种绵羊羔睾丸细胞，一旦出现CPE，可进行包涵体染色检查。

③ 判定。羊痘病毒感染绵羊羔睾丸细胞的特征性CPE为细胞收缩变圆、界限明显、间隙变宽，形成拉网状细胞脱落，并形成嗜酸性包涵体。包涵体大小不等，最大的约为细胞核的一半。

2）电镜负染检查法

① 材料。待检组织载玻片、400目电镜、碳网膜、Tris EDTA（pH7.8）缓冲液、1.0%磷钨酸（pH7.2）。

② 方法

a.样品制备：取待检组织，无菌剪碎，用组织匀浆器研磨，按1∶5的比例加入MEM培养液制备组织悬液。

b.制片。取一滴组织悬液置于载玻片上，将碳网膜漂浮于液滴上1min；将 Tris EDTA（pH7.8）缓冲液滴加到碳网膜上浸泡20s；用滤纸吸干膜上液体，滴加1.0%磷钨酸（pH7.2）染色10s，用滤纸吸干膜上液体，待其自然干燥后用透射电镜观察。

c.病毒形态判定。在电镜下观察，病毒粒子呈卵圆形，大小为150～180nm。

3）包涵体检查

① 材料。组织病料（置于福尔马林溶液中或4℃保存备用）、载玻片、苏木精-伊红（H.E）染色液。

② 方法。取组织病料，用切片机切成薄片置于载玻片上，或直接将病料在载玻片上制成压片（触片）。经H.E染色，置于光学显微镜下观察。

③ 判定。羊痘病毒感染细胞的细胞质内应有不定形的嗜酸性包涵体，细胞核内应有空泡。

4）中和试验

① 材料。MEM培养液（配制方法见附录A）、绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B）、羊痘抗原及阳性血清、待检羊组织。

② 方法

a.样品制备。按1）的方法将待检样品接种细胞，并培养至出现CPE时收获冻融后的细胞悬液，备用。

b.抗原及阳性血清。阳性血清，恢复至室温备用。标定羊痘抗原滴度，并将抗原液用 Hank’s液进行系列稀释至100TCID50/0.1ml。

c.加样。取96孔细胞培养板，待检样品的细胞悬液、羊痘抗原（100TCD50/0.1ml）各加2孔，每孔0.1ml，向其中一孔加入等量阳性血清，向另一孔内加入等量 Hank’s液；阳性血清加1孔，每孔0.1ml，再向孔内加入等量 Hank’s液，作为阳性血清对照；Hank’s液加1孔，每孔0.2ml，作为空白对照。

d.感作。将96孔细胞培养板摇匀后置于37℃水溶液中1h，其间每15min振摇1次。

e.培养。取生长良好的绵羊羔睾丸细胞单层1瓶，按常规方法消化，调整细胞浓度至10个/ml，每孔接种细胞悬液0.1ml。接种后，置于37℃、5% CO2条件下培养。

f.观察。培养4～7d，每日观察CPE情况。

③ 结果判定。当正常细胞对照孔、羊痘抗原中和对照孔、阳性血清对照孔的细胞均无CPE，而羊痘抗原对照孔细胞有特征性CPE时，试验成立。待检样品中和试验孔细胞无CPE，而待检样品未中和试验孔的细胞有特征性CPE时，判定该待检抗原为羊痘抗原。

5）PCR试验

① 材料。待检样品、羊痘病毒对照、DNA提取试剂盒、2×K Taq Master Mix（商品化试剂）、1.5%琼脂糖凝胶、1×TAE缓冲液（商品化试剂）、 DNA Marker1（商品化试剂）、上样缓冲液（商品化试剂）、高压灭菌的去离子水、PCR仪、台式高速冷冻离心机、电泳仪、电泳槽、冰箱、凝胶成像系统、微量移液器、水浴锅、涡旋仪等。

② 方法

a.样品处理。取待检组织（皮肤或其他组织），无菌剪碎，用组织匀浆器研磨；按1∶10的比例加入MEM培养液制备组织悬液，4℃过夜；1500r/min离心10min，取上清备用；冻融的抗凝血、精液或培养上清液等液体样品取0.2ml备用。

b.DNA提取，在0.2ml血液样品中加入2μl蛋白酶K溶液（20mg/ml）或0.8ml组织样品中加入10μl蛋白酶K溶液。按DNA提取试剂盒说明书或以下方法提取DNA。将上述样品56℃孵育2h或过夜，再100℃加热10h。按样品体积1∶1的比例加入等体积的苯酚、氯仿和异戊醇溶液（体积比为25∶24∶1）。振荡均匀，室温孵育10min。将样品4℃、16000g离心15min。小心收集上层水相（约200μl），并转移到2.0ml小管中，并加入等体积的冷乙醇和1/10体积的醋酸钠（3mol/L，pH5.3），将样品置于20℃静置1h。将样品4℃、16000g离心15min，去掉上清液。用70%冷乙醇（100μl）洗涤沉淀，并4℃、16000g离心1min，弃去上清液，并彻底干燥。用30μl无RNA水悬浮溶解沉淀，置于－20℃保存，备用。

c.引物合成。按下列引物序列合成引物。

正向引物：5’-TCC-GAG-CTC-TTT-CCT-GAT-TTT-TCT-TAC-TAT-3’。

反向引物：5’-TAT-GGT-ACC-TAA-ATT-ATA-TAC-GTA-AAT-AAC-3’。

d.PCR扩增体系。按下列方法配制50μl PCR扩增反应体系：

10×PCR缓冲液　　　  　5μl

50mmol/L MgCl2 　　    　1.5μl

10mmol/L DNTP　　　　1μl

上游引物　　　　　　 　1μl

下游引物　　　　　　 　1μl

DNA模板（约10ng）　　1μl

无核酸酶水　　　　　 　39μl

e.PCR扩增条件。按下列程序进行PCR扩增：先95℃变性2min，然后按95℃变性45s、50℃退火50s、72℃延伸60s的顺序循环，共循环34次，最后在72℃温度下延伸2min，于4℃保存，备用。

f.PCR产物电泳。每个样品取10μl与上样缓冲液充分配匀，再每管取5μl加入琼脂糖凝胶板的加样孔中，在位于凝胶中央的孔加入DNA分子量标准。加样后，按照8～10V/cm电压，电泳40～60min（每次电泳时，每隔10min观察1次。当加样缓冲液中溴酚蓝电泳过半至凝胶下2/5处时，可停止电泳）。电泳后，置于紫外凝胶成像仪下观察，用分子量标准判断PCR扩增产物大小。

g.结果判定。羊痘病毒阳性对照出现192bp的扩增条带，且阴性对照无此扩增带时，判定检测有效；否则判定检测结果无效，不能进行判断。被检样品出现192bp扩增带为羊痘病毒阳性，否则为阴性。

（4）血清学试验-中和试验法

1）材料　MEM培养液（配制方法见附录A）、绵羊羔睾丸细胞（制备方法见附录B）、羊抗原及阳性血清、待检羊血清。

2）方法

① 样品处理。经静脉无菌采集待检羊血，按常规方法分离血清，56℃灭活30min后备用。

② 抗原及阳性血清。阳性血清，恢复至室温备用。标定羊抗原滴度，并将抗原液用Hank’s液进行系列稀释至100TCID50/0.1ml。

③ 加样。取96孔细胞培养板，待检血清、阳性血清各加2孔，每孔0.1ml，向其中一孔加入等量羊抗原（100TCID50/0.1ml），向另一孔内加入等量Hank’s液；羊痘抗原（100TCID50/0.1ml）加1孔，加入0.1ml，再向孔内加入等量Hank’s液，作为抗原对照；Hank’s液加1孔，加入0.2ml，作为空白对照。

④ 感作。将96孔细胞培养板摇匀后置于37℃中和1h，其间每15min振摇1次。

⑤ 培养。取生长良好的绵羊羔睾丸细胞单层1瓶，按常规方法消化，调整细胞浓度至10个/ml，每孔接种细胞悬液0.1ml。接种后，置于37℃、5% CO2条件下培养。

⑥ 观察。培养4～7d，每天观察CPE情况。

3）结果判定　当正常细胞和血清毒性对照孔细胞无CPE，而接种抗原对照孔细胞有明显CPE时，试验成立。

待检血清中和后，试验孔细胞出现特征性CPE，判定该血清为羊痘病毒抗体阴性；待检血清中和后，试验孔细胞未出现CPE，判定该血清为羊痘病毒抗体阳性。

附录A

（规范性附录）

营养液及溶液的配制

A.1　Hank’s液（10×浓缩液）

A.1.1　成分

A.1.1.1　成分甲

氯化钠　　　　80.0g

氯化钾　　　　4.0g

氯化钙　　　　1.4g

硫酸镁　　　　2.0g

A.1.1.2　成分乙

磷酸氢二钠　　　　1.52g

磷酸二氢钾　　　　0.6g

葡萄糖　　　　        10.0g

1.0%酚红　　　   　16.0ml

A.1.2　配制方法

按顺序将上述成分分别溶于450ml注射用水中，即配成甲液和乙液，然后将乙液缓缓加入甲液，边加边搅拌。补足注射用水至1000ml，用滤纸过滤后，加入三氯甲烷2ml，置于2～8℃保存。

A.1.3　使用

使用时，用注射用水稀释10倍，107.6kPa灭菌15min，置2～8℃保存备用，使用前，用7.5%碳酸氢钠溶液调pH至7.2～7.4。

A.2　7.5%碳酸氢钠溶液

A.2.1　成分

碳酸氢钠　　　     　7.5g

注射用水　　　　　100 ml

A.2.2　配制方法

将上述成分溶解，0.2μm滤器滤过除菌，分装于小瓶中，置－20℃保存。

A.3　1.0%酚红溶液

A.3.1　成分

酚红　　　                　10.0g

1mol/L氢氧化钠溶液　不超过60 ml

注射用水补足至1000ml

A.3.2　配制方法

1mol/L氢氧化钠溶液的制备：取澄清的氢氧化钠饱和液56.0ml，加注射用水至1000ml即可。称酚红10.0g，加1mol/L氢氧化钠溶液20ml，搅拌溶解。静置后，将已溶解的酚红溶液倒入1000ml容器内。未溶解的酚红继续加入1mol/L氢氧化钠溶液20ml，搅拌使其溶解。如仍未完全溶解，可继续加少量1mol/L氢氧化钠溶液搅拌。如此反复，直至酚红完全溶解，但所加1mol/L氢氧化钠溶液总量不得超过60ml。补足注射用水至1000ml，分装小瓶，107.6kPa灭菌15min后，置2～8℃保存。

A.4　0.25%胰蛋白溶液

A.4.1　成分

氯化钠　　　                        　8.0g

氯化钾　　　                        　0.2g

柠檬酸钠　　                    　　1.12g

磷酸二氢钠　　                    　0.056g

碳酸氢钠　　                    　　1.0g

葡萄糖　　　　                    　1.0g

胰蛋白酶（1∶250）　　　　2.5g

注射用水加至1000ml

A.4.2　配制方法

待胰酶充分溶解后，0.2μm滤器滤过除菌，分装于小瓶中，置于－20℃保存。使用时，用7.5%碳酸氢钠溶液调pH至7.4～7.6。

A.5　EDTA-胰蛋白酶分散液（10×浓缩液）

A.5.1　成分

氯化钠　　　                    　　80.0g

氯化钾　　　                    　　4.0g

葡萄糖　　　                    　　10.0g

碳酸氢钠　　　                 　　5.8g

胰蛋白酶（1∶250）　　　　5.0g

乙二胺四乙酸二钠　　     　　2.0g

按顺序溶于900ml注射用水中，然后加入下列各液：

1.0%酚红溶液　　　            　2.0ml

青霉素（10万IU/ml）　　　　10.0ml

链霉素（10万μg/ml）　　　   10.0ml

补足注射用水至1000ml

A.5.2　配制方法

将上述成分按顺序溶解，0.2μm滤器滤过除菌，分装小瓶，－20℃保存。临用前，用注射用水稀释10倍，作为分散工作液，适量分装，置于－20℃冻存备用。分散细胞时，将工作液取出，置于37℃水浴融化，并用7.5%碳酸氢钠溶液调pH至7.6～8.0。

A.6　抗生素溶液（1万IU/ml）

A.6.1　　　                       　10×浓缩液

青霉素　　　                    　400万IU

链霉素　　　　                    400万μg

注射用水　　　                　40 ml

充分溶解后，0.2μm滤器滤过除菌，分装小瓶，置于－20℃保存。

A.6.2　工作溶液

取上述10×浓缩液适量，用注射用水稀释10倍，分装后置于－20℃保存。

A.7　H.E染色液

A.7.1　Harris苏木精染液

苏木精无水乙醇　　 　  　1.0g

硫酸铝钾　　　　　       　10.0ml

蒸馏水　　　　　　　　　200.0ml

氧化汞　　　                   　0.5g

冰醋酸　　　                   　8.0ml

先用无水乙醇溶解苏木精，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，再将这两种液体混合后煮沸（约1min）。离火后，向该混合液中迅速加入氧化汞，并用玻璃棒搅拌染色液直至变为紫红色，用冷水冷却至室温，然后，加入冰醋酸并混合均匀，过滤后使用。

A.7.2　伊红染液

伊红染液有水溶性和醇溶性2种，常用0.5%水溶性伊红染液，配方如下：

伊红Y　　　                     　0.5g

蒸馏水　　                   　　100ml

冰醋酸　　　                   　1滴

先用少许蒸馏水溶解伊红Y，然后加入全部蒸馏水，用玻璃棒搅拌均匀。用冰醋酸将染液调至pH4.5左右，过滤后使用。

A.7.3　盐酸-乙醇分化液

浓盐酸　　　                   　1.0ml

75%乙醇　　               　　99.0ml

A.8　MEM培养液

A.8.1　成分

MEM干粉培养基按说明书要求

注射用水　　　             　1000ml

A.8.2　配制方法

称取适量干粉培养基，加入注射用水500ml，磁力搅拌使之完全溶解，根据说明书要求补加碳酸氢钠、谷氨酰胺和其他特殊物质，加水定容到终体积，调节pH7.4～7.6，0.2μm滤膜过滤除菌，无菌分装，2～8℃保存备用。

配制好的培养液用前加入胎牛血清，细胞培养液胎牛血清含量为5%～10%，细胞维持液胎牛血清含量为1%～2%。

附录B

（规范性附录）

绵羊羔睾丸细胞的制备

B.1　原代细胞制备

取4月龄以内健康雄性绵羊，以无菌手术摘取睾丸，剥弃白膜，剪成1～2mm小块，用Hank’s液（见附录A）清洗3～4次。按睾丸组织量的6～8倍加入0.25%胰酶溶液（见附录A），置于37℃水浴消化。待睾丸组织呈膨松状，弃去胰酶溶液，用玻璃珠振摇法分散细胞，并用MEM培养液稀释成每毫升含100万左右细胞数，分装细胞瓶，37℃静置培养，2～4d即可长成单层。

B.2　次代细胞制备

取生长良好的原代细胞弃去生长液，加入原培养液量1/10的EDTA-胰蛋白酶分散液（见附录A），消化2～5min。待细胞层呈雪花状时，弃去胰酶分散液。加少许MEM培养液吹散细胞，然后按1∶2的分种率，补足MEM培养液。混匀、分装细胞瓶，置于37℃静置培养。细胞传代应不超过5代。