第三节　牛、羊病

一、口蹄疫

口蹄疫（属一类传染病）俗名“口疮”“辟癀”，是由口蹄疫病毒所引起的偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。是猪、牛、羊等主要家畜和其他家养、野生偶蹄动物共患的一种急性、热性、高度接触性传染病，易感动物达70多种。临床特征是在口腔黏膜、蹄部和乳房皮肤发生水疱性疹。该病传播途径多、速度快，曾多次在世界范围内暴发流行，造成巨大经济损失。鉴于此，世界动物卫生组织（OIE）将其列为A类传染病之首，我国将其列为一类动物疫病。

（一）病毒特征

口蹄疫病毒（FMDV）属于小RNA病毒科（Picornaviridae）口疮病毒属（ApHthovirus），是偶蹄类动物高度传染性疾病（口蹄疫）的病原。其最大颗粒直径为23nm，最小颗粒直径为7～8nm，在病毒的中心为一条单链的正链RNA，由大约8000个碱基组成，是感染和遗传的基础；周围包裹着的蛋白质决定了病毒的抗原性、免疫性和血清学反应能力；病毒外壳为对称的20面体。FMDV的免疫是依赖T细胞的B细胞应答，疫苗接种主要诱导中和抗体的产生。

目前已知口蹄疫病毒在全世界有七个主型，包括 A、O、C、南非1、南非2、南非3和亚洲1型，以及65个以上亚型。O型口蹄疫为全世界流行最广的一个血清型，我国流行的口蹄疫主要为O、A、C三型及ZB型（云南保山型）。据观察，一个地区的牛群经过有效的口蹄疫疫苗注射之后，1～2月内又会流行，这往往怀疑是另一型或亚型病毒所致。其实是因为该病毒易发生变异。

该病毒对外界环境的抵抗力很强，在冰冻情况下，血液及粪便中的病毒可存活120～170d。阳光直射下60min即可杀死；加温至85℃15min、煮沸3min即可死亡。对酸碱敏感，故1%～2%氢氧化钠、30%热草木灰、1%～2%甲醛等都是良好的消毒液。

（二）临床症状

该病潜伏期1～7d，平均2～4d病牛精神沉郁，闭口，流涎，开口时有吸吮声，体温可升高到40～41℃。发病1～2d后，病牛齿龈、舌面、唇内面可见到蚕豆到核桃大的水疱，涎液增多并呈白色泡沫状挂于嘴边。采食及反刍停止。水疱约经一昼夜破裂，形成溃疡，这时体温会逐渐降至正常。在口腔发生水疱的同时或稍后，趾间及蹄冠的柔软皮肤上也发生水疱，也会很快破溃，然后逐渐愈合。有时在乳头皮肤上也可见到水疱。本病一般呈良性经过，经1周左右即可自愈；若蹄部有病变则可延至2～3周或更久；死亡率1%～2%，这种病型叫良性口蹄疫。有些病牛在水疱愈合过程中，病情突然恶化，全身衰弱、肌肉发抖、心跳加快、节律不齐，食欲废绝、反刍停止，行走摇摆、站立不稳，往往因心脏麻痹而突然死亡，这种病型叫恶性口蹄疫，死亡率高达25%～50%。犊牛发病时往往看不到特征性水疱，主要表现为出血性胃肠炎和心肌炎，死亡率极高。

（三）病理变化

除口腔和蹄部病变外，还可见到食道和瘤胃黏膜有水疱和烂斑；胃肠有出血性炎症；肺呈浆液性浸润；心包内有大量混浊而黏稠的液体。恶性口蹄疫可在心肌切面上见到灰白色或淡黄色条纹与正常心肌相伴而行，如同虎皮状斑纹，俗称“虎斑心”。

（四）流行病学特征

牛尤其是犊牛对口蹄疫病毒最易感，骆驼、绵羊、山羊次之，猪也可感染发病。本病具有流行快、传播广、发病急、危害大等流行病学特点，疫区发病率可达50%～100%，犊牛死亡率较高，其他则较低。病畜和潜伏期动物是最危险的传染源。病畜的水疱液、乳汁、尿液、口涎、泪液和粪便中均含有病毒。该病入侵途径主要是消化道，也可经呼吸道传染。本病传播虽无明显的季节性，但春秋两季较多，尤其是春季。风和鸟类也是远距离传播的因素。

口蹄疫传染途径多、速度快。发病或处于潜伏期的动物是主要传染源。病毒可通过空气、灰尘，病畜的水疱、唾液、乳汁、粪便、尿液、精液等分泌物和排泄物，被污染的饲料、褥草以及接触过病畜的人员的衣物传播。口蹄疫通过空气传播时，病毒能随风散播到50～100km以外的地方。牛、羊、猪等高易感动物，感染发病率几乎为100%。一般来说，成年动物患口蹄疫的死亡率在5%～20%之间，幼畜的死亡率50%～80%。口蹄疫病毒血清类型多，易变异。已发现的口蹄疫病毒有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1 7个血清型。各型的抗原不同，不能相互免疫。

（五）预防及治疗

动物患口蹄疫会影响使役，减少产奶量，一般采用宰杀并销毁尸体进行处理，给畜牧业造成严重损失。国际兽疫局将口蹄疫列为“A类动物传染病名单”中的首位。世界上许多国家把口蹄疫列为最重要的动物检疫对象，中国把它列为“进境动物检疫一类传染病”。口蹄疫很少感染人类，但人类接触或摄入污染的畜产品后，口蹄疫病毒会通过受伤的皮肤和口腔黏膜侵入人体。人口蹄疫的特征是突然发热，口、咽、掌等部位出现大而清亮的水疱，无有效的治疗办法，这些症状经2～3周后可自然恢复，不留疤痕。因此，对人体健康的危害不大。

有效防治猪口蹄疫的措施为做好日常预防工作。减少猪口蹄疫发生的关键在于预防，主要应采取以下措施：

（1）消毒　消毒是日常预防工作的重点，选择口蹄疫敏感消毒剂，在多发季节要每天利用消毒剂进行1 次消毒，其他时间段一个星期消毒1～2 次。消毒范围包括猪场大门、猪圈门口、猪蹄等，最好在猪圈门口设置消毒池，便于消毒。

（2）口蹄疫接种　相关部门要加强猪口蹄疫疫苗接种宣传，并指导养殖户选择正确的接种疫苗。具体来说要做好以下三点：第一，对于疫区来说，可采取自制的康复血清对小猪接种，预防小猪因突发急性心肌炎死亡。第二，对于规模化养殖场来说，要采取疫苗注射、消毒、病猪及时隔离等措施，特别是在高发季节。一旦发生口蹄疫，则要立即隔离病猪，并扑杀病情严重、传染性强的猪，并注射康复血清。第三，严格按照免疫程序执行。根据猪口蹄疫发病特点、病理、症状等制定合理的免疫程序并严格执行。一般来说种母猪1 年要免疫2～3 次，且配种前必须免疫1 次；对于初产母猪来说，配种期间要免疫2 次，且2 次免疫间相隔1 个月左右。对于小猪来说，在其出生55～65d 之间，要进行第1 次免疫，随后25～30d 内进行第二次免疫。第四，选择高效、正确的疫苗。可采用合成肽疫苗，且接种疫苗时要辅以黄芪多糖，既可以保护猪，减少不良反应，而且可以提高免疫效果。

治疗对策：对症治疗，促进创口愈合。根据病猪不同临床表现采取针对性的治疗方法。对于临床症状无特异性、纳差的病猪来说，采取口蹄一针灵、黄芪多糖等治疗，治疗1天。且在饲料或水中适当添加维生素C，补充营养。对于乳房、猪蹄水疱明显的病猪来说，采取黄芪多糖、阿莫西林及恩诺沙星联合治疗，1 次/d，治疗3d。同时用碘甘油涂抹创口，高锰酸钾治疗口腔内溃疡等。对于康复期的病猪来说，要连续给予阿莫西林治疗7～10d。此外，口蹄疫发病期间，要用碘制剂、过氧乙酸等合理消毒，1 次/d。同时火碱冲洗空猪圈及病死猪圈，其他地方撒生石灰。年龄、体重不同，治疗方案不同。超过25kg的猪只需消炎排毒，如采用阿莫西林。若疼痛难忍，则给予破痛宁治疗，缓解猪疼痛，使之能站立进食。若病猪出现口腔内溃疡症状，则要用高锰酸钾冲洗口腔。乳房等部位可涂抹青霉素软膏。不足1kg的猪可能存在急性心肌炎潜在威胁，为此要行康复血清紧急接种，降低死亡率。

若刚起水疱，水疱没有破裂，只需用口蹄一针灵注射一次，水疱即可干瘪消失。若口鼻、蹄子周围的水疱已破溃、流血，甚至蹄壳已脱落，需用口蹄一针灵注射两次，水疱破溃处可结痂。每瓶100kg体重配合核酸肽连续注射2d。

发生口蹄疫的重疫区：

（1）尽早注射，越早越好，病毒控制在潜发期，提高猪群免疫力。

（2）已感染猪群注射两天，4～5d结痂脱落后完全恢复正常，可解除隔离。

（3）对感染后恢复的弱仔群体，每天加强消毒，5d后再注射一针，防止再次感染。

疫区净化：若发生口蹄疫，则要全面、及时地对整个疫区进行消毒、封锁、上报等工作，争取把疫情损失降到最低。

（六）实验室检测

口蹄疫诊断技术

依据标准：GB/T 18935—2018。

1.定型酶联免疫吸附试验（定型ELISA）

（1）器材　酶标仪、与96孔标板配套使用的旋转振荡器、恒温培养箱、洗板机或洗涤瓶、96孔平底聚苯乙烯酶标板、“U”形96孔稀释板、微量可调移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、1000μl等不同规格）、与移液器匹配的吸头、贮液槽、封板膜、吸水纸巾。

（2）试剂

1）捕获抗体　各型兔抗FMDV146s抗血清，由提纯的各型FMDV146s完整病毒粒子免疫兔子制备而成，用pH9.6的包被缓冲液将捕获抗体稀释至工作浓度。

2）检测抗体　各型豚鼠抗FMDV146s抗原抗血清，用与制备捕获抗体相同的FMDV146S免疫豚鼠制备而成；或者是辣根过氧化物酶（HRP）标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体，用酶标抗体稀释液稀释至工作浓度。

3）对照抗原　FMDV灭活抗原。FMDV于单层BHK-21细胞上繁殖，病毒培养液经二乙烯亚胺灭活后离心除去细胞碎片，上清液作为对照抗原，使用时用样品稀释液稀释至工作浓度。

4）包被缓冲液　碳酸盐缓冲液，0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6。

5）样品稀释液　含0.05%（体积分数）吐温-20的0.01mol/L PBS，pH7.2～7.4，配方见附录B。

6）酶标抗体稀释液　按5%（质量浓度）比例在样品稀释液中加入脱脂奶粉。

7）洗涤缓冲液　含0.01%（体积分数）吐温-20的0.01mol/L PBS，配方见附录A。

8）底物溶液　OPD底物溶液，配方见附录A；TMD底物溶液，配方见附录A。

9）终止液　1.25mol/L硫酸，配方见附录A；2mol/L硫酸，配方见附录A。

10）兔抗豚鼠IgG HRP标记物　用健康兔血清阻断，用酶标抗体稀释液释至工作浓度。

（3）试验程序

1）包被酶标板　将工作浓度的捕获抗体分别包被 ELISA板第1至第12列（也可根据待检样品数量调整包被孔数），按O、A、Asia1型的顺序包被酶标板，每个血清型包被1列，每孔加50μl，用封板膜封板，置于4℃过夜（或38℃±0.5℃，100～200r/min振荡孵育2h）。

2）洗涤　每孔中加满洗涤缓冲液，放置30s后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸上拍干酶标板。

3）加对照抗原和待检病原样品　ELISA板第1列A、B两孔加O型抗原，第2列A、B两孔加A型抗原，第3列A、B两孔加Asia1型抗原，依此类推，其余孔加被检样品，每份样品每个血清型加2孔，每孔加50μl，每型设2孔阴性对照，阴性对照孔每孔加50μl样品稀释液。用封板膜封板，置于38℃±0.5℃旋转振荡器中振荡60min。同2）洗涤。

4）加豚鼠抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP标记物或加各型抗 FMDV 型特异性单克隆抗体工作液。

将工作浓度的豚鼠抗 FMDV 各型抗血清逐个加入与包被兔抗 FMDV抗血清同型的各孔，即包被兔抗O型FMDV抗血清的孔加豚鼠抗O型FMDV抗血清，包被兔抗A型FMDV抗血清的孔加豚鼠抗A型FMDV抗血清，依此类推，每孔加50μl，封板后同前振荡孵育60min，同2）洗涤后加兔抗豚鼠IgG HRP标记物，每孔加50μl，封板后同前振荡孵育45min，同2）洗涤。或者将工作浓度 HRP标记的各型抗FMDV型特异性单克隆抗体加入包被同型兔抗血清的各孔和阴性对照孔，每孔加50μl， 封板后同前振荡孵育60min，同2）洗涤。

5）加底物溶液、终止液，判读结果　加豚鼠抗FMDV各型抗血清和兔抗豚鼠IgG HRP标记物时，洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的OPD底物溶液，每孔加50μl，封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15min。每孔加50μl 1.25mol/L 终止液，混匀后在酶标仪492nm下判读结果。加HRP标记的各型抗 FMDV型特异性单克隆抗体时，洗涤板子后加入预热至38℃±0.5℃的TMD底物溶液，每孔加50μl，封板，避光38℃±0.5℃振荡孵育15min。每孔加50μl 2mol/L硫酸终止液，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。

（4）试验成立条件

1）结果计算　相对OD值=被检样品各血清型平均OD值－同型阴性对照（N）平均OD值。

2）某型阴性对照（N）平均OD值大于0.20，试验不成立。

3）阳性对照OD值应大于或等于0.6，阴性对照应小于或等于0.20，试验成立。

（5）结果判定　在试验成立的前提下，如果样品各型的相对 OD值小于或等于0.20，则该样品为阴性；如果样品某型的相对OD值大于或等于0.3，则判定该样品血清型阳性；如果样品某型的相对OD值大于0.2但小于0.3，则判为可疑，需要重新测定，再次测定结果；若某型的相对OD值小于0.30，则该样品为阴性；如果样品某型的相对OD值大于或等于0.3，则判定该样品该型口蹄疫抗原阳性。

2.多重反转录-聚合酶链式反应（多重 RT-PCR）

（1）器材

1）PCR扩增仪。

2）台式低温高速离心机。

3）稳压稳流电泳仪和水平电泳槽。

4）凝胶成像仪（或紫外透射仪）。

5）微量可调移液器（5μl、10μl、100μl、200μl、1000μl等不同规格）。

6）无核酸酶水处理的离心管与吸头。

7）PCR扩增管。

（2）引物

1）上游引物　下列3条引物为上游引物：

① 5’-GACTCG ACGTCTCCCGCCAACT-3’。

② 5’-ACGACGGGGGCTTTTGCTTTCAC-3’。

③ 5’-CGGGAA ACGCACGAGCAGTATC-3’。

2）下游引物　下列3条引物为下游引物：

① 5’-TGCGGACGGCCACCTACTACTTC-3’。

② 5’-AGCTCCACGAAAAAGTGTCGAG-3’。

③ 5’-CGTGATGTGGCGAGAATGAAGAA-3’。

（3）试剂

1）总 RNA提取试剂

① 变性液：6mol/L异硫氰酸胍或 Trizolreagent。

② 2mol/L乙酸钠（pH4.0）。

③ 酚氯仿抽提液：苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25∶24∶1）混合液。

④ 异丙醇（分析纯）。

⑤ 无核酸酶水：可将焦碳酸二乙酯按0.1%（质量浓度）的量加入双蒸馏水（ddH2O）中制备。

⑥ 75%乙醇：无水乙醇（分析纯）与无核酸酶水按3∶1配制而成。

2）RT-PCR试剂

① 10×一步RNA PCR 缓冲液。

② 反转录酶（AMV），5U/μl。

③ 核糖核酸酶抑制剂（RNaseinhibitor），40U/μl。

④ AMV-Optimized Taq 酶，5U/μl。

⑤ dNTP预混液，包括dATP、dTTP、dCTP、dGTP，各10mmol/L。

⑥ MgCl2，25mmol/L。

3）电泳试剂

① 电泳缓冲液：50×TAE贮存液，临用时加蒸馏水配成1×TAE 缓冲液。

② 琼脂糖：国产或进口的低熔点琼脂糖。

③ 电泳加样缓冲液。

④ DNA Marker（标准分子量）：分子大小范围100～1000bp，100bp梯度。

（4）样品准备

1）本方法适用所有的 FMD病原样品种类，包括水泡皮、水泡液、O-P液、扁桃体、淋巴结、骨髓、肌肉、病毒接种乳鼠与细胞培养物等。

2）阳性对照：已知病毒材料，如FMDV感染的乳鼠或细胞，与待检样品同时提取总RNA，再反转录和 PCR扩增，其扩增产物作为电泳对照样品。

3）阴性对照：未感染的乳鼠或细胞，与待检样品同时提取总RNA，再反转录和 PCR扩增。

（5）试验程序

1）核酸提取　酚氯仿法抽提核酸

① 取待检样品、阴性对照、阳性对照各300μl分别置于1.5ml离心管中，每管加入300μl 变性液，反复混匀，冰水浴5min。

② 每管分别加入60μl 2mol/L乙酸钠（pH4.0），混匀。

③ 每管加800μl苯酚-三氯甲烷-异戊醇（25∶24∶1）混合液，冰水浴5min。

④ 8000r/min离心10min。将上清液转入另一洁净离心管。

⑤ 加800μl异丙醇，混匀，室温放置15min。

⑥ 4℃，12000r/min，离心10min，小心倒掉上清液。尽量倒干液体，留下 RNA 沉淀。

⑦ 加1000μl 75%乙醇，颠倒洗涤沉淀，4℃，10000r/min离心5min，小心倒干液体，室温干燥5～10min。

⑧ 每管加10μl 无核酸酶水，用于溶解 RNA。总RNA 提取液可立即用于PCR 扩增，也可－70℃冰箱保存备用。

2）核酸提取等效方法　可采用等效RNA提取试剂和方法，如采用自动化核酸提取仪和配套核酸抽提试剂进行核酸提取。

3）核酸扩增

① PCR反应混合液配制：10×一步RNA PCR缓冲液50μl，MgCl2 100μl，dNTPs50μl，上下游引物对各30μl，无核酸酶水110μl，在超净工作台中混匀，分装入 PCR 扩增管中，－20℃保存备用。

② 多重 RT-PCR 扩增：在已分装有PCR 反应混合液的 PCR扩增管中分别加入已制备好的总RNA提取液5μl，盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增（50℃反转录30min，94℃预变性2min；然后94℃变性50s，58℃退火50s，72℃延伸60s，共进行35次循环；最后72℃延伸8min）。

4）扩增产物电泳检测

① 1.5%琼脂糖凝胶板的制备：称取1.5g琼脂糖，加入100ml 1×TAE 缓冲液中。加热融化后加5μl（10mg/ml）溴化乙锭，混匀后倒入放置在水平台面上的凝胶盘中，胶板厚5mm左右。依据样品数选用适宜的梳子。待凝胶冷却凝固后拔出梳子（胶中形成加样孔），放入电泳槽中，加1×TAE 缓冲液淹没胶面。

② 加样：取6～8μl PCR扩增产物和2μl加样缓冲液混匀后加入一个加样孔。每次电泳同时设标准DNA Marker、阴性对照、阳性对照。

③ 电泳：电压80～100V 或电流40～50mA，电泳30～40min。

（6）试验成立条件　电泳结束后，取出凝胶板置凝胶成像仪（或紫外透射仪）上观察。阳性对照电泳结果应为三个条带，分别为634bp、483bp和278bp，阴性对照应无扩增条带。

（7）结果判定　符合（6）的条件，被检样品至少扩增出一条DNA条带，且与阳性对照条带分子量大小相符，则该样品判定为FMDV核酸阳性。被检样品无扩增条带，判为FMDV核酸阴性。

3.定型反转录-聚合酶链式反应（定型 RT-PCR）

（1）器材　同2、（1）。

（2）引物　下列为下游引物和分别检测 FMDV7个血清型的上游引物。

① 下游引物（通用）：5’-AGCTTGTACCAGGGTTTGGC-3’。

② 上游引物（O 型）：5’-GCTGCCYACYTCYTTCAA-3’。

③ 上游引物（A 型）：5’-GTCATTGACCTYATGCAVACYCAC-3’。

④ 上游引物（C型）：5’-GTTTCTGCACTTGACAACACA-3’。

⑤ 上游引物（Asia1型）：5’-GACACCACHCARRACCGCCG-3’。

⑥ 上游引物（SAT1型）：5’-AGGATTGCHAGYGAGACVCACAT-3’。

⑦ 上游引物（SAT2型）：5’-GGCGTYGARAAACARYTBTG-3’。

⑧上游引物（SAT3型）：5’-TTCGGDAGAYTGTTGTGTG-3’。

其中，Y、R、H、V、D为简并碱基，Y对应C/T，R对应A/G，H对应A/T/C，V对应G/A/C，D对应A/T/G。

（3）试剂　同2、（3）。

（4）样品准备　同2、（4）。

（5）试验程序

1）核酸提取　同2、（5）、1）。

2）一步法RT-PCR扩增

① RT-PCR反应体系配制，采用25μl反应体系，扩增体系配制如下：

10×一步 RNAPCR缓冲液　　　　　　　       　2.5μl

MgCl2（25mmol/L）　　　　　　　　　　　　5μl

dNTP（各10mmol/L）　　　　　　　　　　　2.5μl

RNase酶抑制剂（40U/μl）　　　　　　　　　0.5μl

AMV（5U/μl） 　　　                                        　0.5μl

AMV-OptimizedTaq （5U/μl）　　　　　   　　0.5μl

下游通用引物（50pmol/μl）　　　　　　  　　0.5μl

上游特异性引物混合（各50pmol/μl） 　　　 　0.5μl

总RNA水溶液　　　                                      　　12.5μl

② 扩增程序。将 PCR扩增管盖紧管盖，放入扩增仪中按照设定程序扩增：50℃反转录30min，94℃预变性4min；然后94℃变性50s，58～60℃退火40s，72℃延伸40s，共进行30次循环；最后72℃延伸8min。

3）扩增产物电泳检测　同2、（5）、3）。

（6）试验成立条件　电泳结束后，取出凝胶板置于凝胶成像仪（或紫外透射仪）上观察。阳性对照扩增产物电泳结果应分别为O型400bp，A型730bp，C型600bp，Asia1型300bp，SAT1型430bp，SAT2型260bp，SAT3型380bp，阴性对照应无扩增条带。

（7）结果判定　符合（6）的条件。样品扩增产物的DNA条带与某型阳性对照条带分子量大小一致，则该待检样品为某型FMDV。如被检样品无扩增条带，则该样品为 FMDV 核酸阴性。

4.液相阻断酶联免疫吸附试验（LPB-ELISA）

（1）器材　同1、（1）。

（2）试剂　同1、（2）。

（3）对照血清

1）阳性对照血清：用与制备兔抗FMDV抗血清抗原同源的FMDV灭活疫苗免疫正常牛制备的高免血清，预先测定其抗体效价。同待检血清一起作同样稀释。

2）阴性对照血清：阴性对照血清来自健康牛，各型口蹄疫 LB-ELISA 抗体效价均小于1∶4。

（4）试验程序

1）ELISA板每孔用50μl pH9.6碳酸盐/碳酸氢盐缓冲液稀释的兔抗血清包被，封板膜封板，置室温过夜。

2）洗涤：每孔中加满洗涤缓冲液，放置30s后弃去，重复洗涤6次后在吸水纸巾上拍干酶标板。

3）在U形96孔稀释板内，按50μl/孔的量用样品稀释液将待检血清从1∶4开始做2倍连续稀释，每份待检血清都做2个重复，然后向每孔内加入相应的50μl同型病毒抗原，封板混合后置4℃过夜或37℃孵育1h。加入病毒抗原后血清的实际稀释度变为从1∶8开始的2倍连续稀释度。

4）用洗涤缓冲液洗ELISA板6次，将各孔血清/抗原混合物从稀释板转移至兔抗血清包被的ELISA板中，每孔50μl，封板，37℃ 孵育1h。

5）洗ELISA板6次，将与试验抗原同源的豚鼠抗血清用样品稀释液稀释至预定的最佳工作浓度，每孔50μl，封板，37℃孵育1h。

6）洗ELISA板6次，每孔加50μl用酶标抗体稀释液稀释的兔抗豚鼠IgG辣根过氧化物酶结合物，封板，37℃孵育1h。

7）洗ELISA板6次，每孔加50μl TMB底物溶液。37℃温育15min后每孔再加50μl 1.25mol/L硫酸终止反应，混匀后在酶标仪450nm下判读结果。

8）对照设立：每次试验，每块板设8孔连续2倍稀释的阳性血清对照，2孔连续2倍稀释的阴性血清对照，设4孔抗原对照，抗原对照不加血清稀释液。

（5）试验成立条件　病毒抗原对照至少两孔OD450nm值应在1.0～2.0范围内；阳性血清对照抗体滴度应在（1∶512）～（1∶2048）之间；阴性血清对照抗体滴度应小于1∶4。

（6）结果判定

1）以病毒抗原对照OD450nm平均值的 1/2为临界值，被检血清稀释孔OD450nm值大于临界值为阴性孔，小于或等于临界值为阳性孔。抗体滴度以50%终点滴度表示，即该稀释度50%孔的抑制率大于抗原对照孔抑制率的50%。

2）被检血清抗体滴度大于或等于1∶128判为阳性。被检血清抗体滴度小于1∶64判为阴性。被检血清抗体滴度大于或等于1∶64并小于1∶128判为可疑，可疑样品经再次测定后，如果有一个滴度为1∶64或更高可判为阳性。

附录A

（规范性附录）

酶联免疫吸附试验用溶液的配制

A.1　包被缓冲液：碳酸盐缓冲液（0.05mol/L Na2CO3-NaHCO3，pH9.6）

A液：Na2CO3 　　　　1.68g

蒸馏水 　　　             　400ml

B液：NaHCO3 　　　　2.86g

蒸馏水 　　　              　200ml

将400ml A液与150ml B液混合，调整pH至9.6，4℃放置1个月有效。

A.2　样品稀释液［含0.05%（体积分数）吐温-20的0.01mol/L PBS，pH7.2～7.4］。

Na2HPO4·12H2O 　　 　0.30g

KH2PO4　　　　　　 　0.02g

NaCl　　　　　　      　0.80g

KCl　　　　　　    　　0.02g

吐温-20　　　         　　0.05ml

加蒸馏水至100ml。

A.3　定型 ELISA、液相阻断 ELISA、固相竞争ELISA 洗涤缓冲液（0.002mol/L PBS，pH7.4±0.2）

Na2HPO4·H2O　　  　　0.60g

KH2PO4 　　　　   　　0.04g

NaCl　　　　　     　　1.60g

KCl　　　　　　       　0.04g

加蒸馏水至1000ml。

A.4　底物溶液

A.4.1　OPD底物溶液

Na2HPO4·12H2O 　　　　            　1.84g

柠檬酸（C6H8O7，分析纯） 　　　0.52g

邻苯二胺（OPD）　　　　　　　0.05g

加去离子水100ml。

分装成3ml/瓶，－20℃ 避光保存。使用前避光融化，每3 ml上述溶液加15μl 3% 双氧水（H2O2）。

A.4.2　TMD底物溶液

A 液：TMB（3，3’，5，5’-Tetramethylbenzidine）　　　 200mg

无水乙醇　　　                                                                    　100ml

蒸馏水加至 1000ml。

B液：磷酸氢二钠（Na2HPO4，分析纯） 　             　　　71.7g

柠檬酸（C6H8O7，分析纯） 　　                                    　　9.33g

0.75%过氧化氢尿素　　　                                              　　6.4ml

加蒸馏水至1000ml，调整pH至5.0～5.4。

将底物溶液A和底物溶液B按1∶1混合，现配现用。

A.5　终止液

A.5.1　1.25mol/L硫酸

取68ml分析纯浓硫酸缓慢加入932ml去离子水中，分装室温保存。

A.5.2　2mol/L硫酸

116ml分析纯浓硫酸缓慢加入884ml去离子水中，分装室温保存。

A.5.3　0.3mol/L硫酸

16.6ml分析纯浓硫酸缓慢加入983.4ml去离子水中，分装室温保存。