四、猪圆环病毒病

猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是一种动物病毒。在20世纪90年代，世界范围内人们在病猪及一些无明显临床症状猪体内检测到了一种新型猪小环状样病毒（Allan和Ellis，2000）。

有人建议将原来的PCV命名为圆环病毒Ⅰ型（PCV-1），将新出现的与临床疾病相关的PCV命名为圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）。PCV-2感染后会出现断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）、猪皮炎肾病综合征（PDNS）、猪呼吸系统混合疾病、繁殖障碍综合征等。现“猪圆环病毒病”（PCVD）的含义是指群体病或是与PCV-2相关的疾病。PCVD中，PMWS对养猪业造成的危害最为严重，在欧洲每年可造成养猪业约6亿欧元的损失。

（一）病毒特征

猪圆环病毒是迄今发现的一种最小的动物病毒。现已知PCV有两个血清型，即PCV1和PCV2。PCV1为非致病性的病毒。PCV2为致病性的病毒，它是断奶仔猪多系统衰竭综合征（Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome，PMWS）的主要病原。本病最早发现于加拿大（1991），很快在欧美及亚洲一些国家包括我国发生和流行，除PMWS外，PDNS（猪皮炎与肾病综合征）、PNP（增生性坏死性肺炎）、PRDC（猪呼吸道疾病综合征）、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联。PCV2及其相关的猪病，死亡率10%～30%不等，较严重的猪场在暴发本病时死淘率高达40%，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征（PRRS）之后新发现的引起猪免疫障碍的重要传染病。

1974年，德国人Tischer发现，猪圆环病毒（PCV）为二十面体对称、无囊膜、单股环状DNA病毒。病毒粒子直径为17nm，是发现的最小的动物病毒。

PCV对外界的抵抗力较强，在pH 3的酸性环境中很长时间不被灭活。该病毒对氯仿不敏感，在56℃或70℃处理一段时间不被灭活。在高温环境也能存活一段时间。不凝集牛、羊、猪、鸡等多种动物和人的红细胞。

在病猪鼻黏膜、支气管、肺脏、扁桃体、肾脏、脾脏和小肠中有PCV粒子存在。胸腺、脾、肠系膜、支气管等处的淋巴组织中均有该病毒，其中肺脏及淋巴结中检出率较高。表明PCV严重侵害猪的免疫系统：病毒与巨噬细胞/单核细胞、组织细胞和胸腺巨噬细胞相伴随，导致患猪体况下降，形成免疫抑制。由于免疫抑制而导致免疫缺陷，其临床表现为：对低致病性或减弱疫苗的微生物可以引发疾病；重复发病对治疗无应答性；对疫苗接种没有充分免疫应答；在一窝猪中有一头以上发生无法解释的出生期发病和死亡；猪群中同时有多种疾病综合征发生。这些特征在PMWS的猪群中基本上都有不同程度的发生。

淋巴细胞缺失和淋巴组织的巨噬细胞浸润，是PMWS病猪的独特性病理损害和基本特征。而且此特征与血液循环中B及T细胞减少和淋巴器官中这类细胞的减少呈高度相关；与周围血液和淋巴组织中巨噬细胞/单核细胞谱系细胞的增加呈高度相关。另外已证实淋巴组织、相关免疫细胞和血液中的细胞存在大量的PCV2抗原。

（二）临床症状

最常见的是猪只渐进性消瘦或生长迟缓，这也是诊断PMWS所必需的临床依据，其他症状有厌食、精神沉郁、行动迟缓、皮肤苍白、被毛蓬乱，呼吸困难、咳嗽为特征的呼吸障碍（图1-47）。较少发现的症状为腹泻和中枢神经系统紊乱。发病率一般很低而病死率都很高。体表浅淋巴结肿大，肿胀的淋巴结有时可被触摸到，特别是腹股沟浅淋巴结；贫血和可视黏膜黄疸。在1头猪可能见不到上述所有临床症状，但在发病猪群可见到所有的症状。胃溃疡、嗜睡、中枢神经系统障碍和突然死亡较为少见。绝大多数PCV2是亚临床感染。一般临床症状可能与继发感染有关，或者完全是由继发感染所引起的。在通风不良、过分拥挤、空气污浊、混养以及感染其他病原等因素时，病情明显加重，一般病死率为10%～30%。

先天性颤抖的症状：颤抖由轻微到严重不等，一窝猪中感染的数目也变化较大。严重颤抖的病仔猪常在出生后1周内因不能吮乳而饥饿致死。耐过1周的乳猪能存活，3周龄时康复。颤抖是两侧性的，乳猪躺卧或睡觉时颤抖停止。外部刺激如突然声响或寒冷等能引发或增强颤抖。有些猪一直不能完全康复，整个生长期和育肥期继续颤抖。发病窝猪常为新引入的年轻种猪所生，这表明这些血清学阴性种猪在怀孕的关键期接触了PCV。

常见的混合感染：PCV感染可引起猪的免疫抑制，从而使机体更易感染其他病原，这也是圆环病毒与猪的许多疾病混合感染有关的原因。最常见的混合感染有PRRSV病、PrV（伪狂犬病毒）病、PPV（细小病毒）病、肺炎支原体病、多杀性巴氏杆菌病、PEDV（流行性腹泻病毒）病、SIV（猪流感病毒）病，有的呈二重感染或三重感染，其病猪的病死率也将大大提高，有的可达25%～40%。

（三）病理变化

剖检病变：本病主要的病理变化为患猪消瘦，贫血，皮肤苍白，黄疸（疑似PMWS的猪有20%出现）；淋巴结异常肿胀（图1-48），内脏和外周淋巴结肿大到正常体积的3～4倍，切面为均匀的白色；肺部有灰褐色炎症和肿胀，呈弥漫性病变，密度增加，坚硬似橡皮样；肝脏发暗，呈浅黄到橘黄色外观，萎缩，肝小叶间结缔组织增生；肾脏水肿（有的可达正常的5倍），苍白，被膜下有坏死灶；脾脏轻度肿大，质地如肉；胰、小肠和结肠也常有肿大及坏死病变（图1-49）。

组织学病变：病变广泛分布于全身器官、组织，广泛性的病理损伤。肺有轻度多灶性或高度弥漫性间质性肺炎；肝脏有以肝细胞的单细胞坏死为特征的肝炎；肾脏有轻度至重度的多灶性间质性肾炎；心脏有多灶性心肌炎。在淋巴结、脾、扁桃体和胸腺常出现多样性肉芽肿炎症。PMWS病猪主要的病理组织学变化是淋巴细胞缺失。

（四）流行病学特征

PMWS是最早被认识和确认的由PCV2感染所致的疾病。常见的PMWS主要发生在5～16周龄的猪，最常见于6～8周龄的猪，极少感染乳猪。一般于断奶后2～3天或1周开始发病，急性发病猪群中，病死率可达10%，耐过猪后期发育明显受阻。但常常由于并发或继发细菌或病毒感染而使死亡率大大增加，病死率可达25%以上。血清学调查表明，PCV在世界范围内流行。在德国和加拿大，猪群中PCV抗体阳性率分别高达95%和55%，在英国和爱尔兰，猪群中PCV抗体阳性率分别高达86%和92%，但不一定表现PMWS症状。在我国对部分省市猪群检测，20日龄未断奶仔猪阳性率为0，1～2月断奶仔猪阳性率为16.5%，后备母猪阳性率为42.3%，经产母猪阳性率为85.6%，肥育猪阳性率为51%，总阳性率为42.9%。临床症状可能在几个月内持续存在，在6～12个月达到高峰，接着下降；一群与另一群之间的感染有很大差别，因为乳猪体内母源的PCV抗体在其出生后8～9周龄时消失，而小猪转移到育肥圈时（11～13周龄）又接触了PCV，PCV抗体又出现了。

猪对PCV2具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。怀孕母猪感染PCV2后，可经胎盘垂直传播感染仔猪。人工感染PCV2血清阴性的公猪后精液中含有PCV2的DNA，说明精液传播可能是另一种传播途径。用PCV2人工感染试验猪后，其他未接种猪的同居感染率是100%，这说明该病毒可水平传播。猪在不同猪群间的移动是该病毒的主要传播途径，也可通过被污染的衣服和设备进行传播。

工厂化养殖方式可能与本病有关，饲养管理不善、恶劣的断奶环境、不同来源及年龄的猪混群、饲养密度过高及刺激仔猪免疫系统均为诱发本病的重要危险因素，但猪场的大小并不重要。

PCV感染试验动物，发现只有猪产生特异性抗体，而兔、鼠、牛，甚至人均为血清学试验阴性。

PCV1对猪无致病性，但能产生血清抗体，并且在调查的猪群中普遍存在。

PCV2可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS），并多发于5～16周龄的猪。

PCV能水平传播，接触病毒后1周， 血清中能检出抗体，随后滴度不断升高。

（五）预防及治疗

本病无有效的治疗方法，加上患猪生产性能下降和高死亡率，使本病显得尤为重要。而且因为PCV2的持续感染，使本病在经济上具有更大的破坏性。抗生素的应用和良好的管理有助于解决并发感染的问题。

加强饲养管理：降低饲养密度，实行严格的全进全出制和混群制度，减少环境应激因素，控制并发感染，保证猪群具有稳定的免疫状态，加强猪场内部和外部的生物安全措施，购猪时保证猪来自清洁的猪场，是预防控制本病、降低经济损失的有效措施。专利消毒剂Virkon S在1∶250稀释消毒时能有效杀灭圆环病毒，因此可将其应用于每批猪之间的终端消毒。

做好猪主要传染病的免疫工作：PCV2与其相关猪病的发生还需要另外的条件或共同因素才得以诱发。世界各国控制本病的经验是对共同感染源作适当的主动免疫和被动免疫，所以做好猪场猪瘟、猪伪狂犬病、猪细小病毒病、气喘病和蓝耳病等疫苗的免疫接种，确保胎儿和吮乳期仔猪的安全是关键。因此根据不同的可能病原和不同的疫苗对母猪实施合理的免疫程序至关重要。

人工被动免疫：可采取血清疗法。从猪场的育肥猪采血（健康的淘汰种猪血最好），分离血清，给断乳期的仔猪腹腔注射。

自家疫苗的使用：猪场一旦发生本病，可把发病猪的内脏加工成自家疫苗，据临床实践，效果不错。但现阶段有两种观点。一是母猪和断奶仔猪同时免疫，优点是免疫效果快，基本在1～2月内能控制本病；缺点是如果灭活不彻底，将使本病长期存在。二是只免疫断奶仔猪，优点是免疫安全性好，基本不会使本病长期存在；缺点是免疫效果慢，需要半年左右的时间才能控制本病。

“感染”物质的主动免疫：“感染”物质指本猪场感染猪的粪便、死产胎猪、木乃伊胎等，用来喂饲母猪，尤其是初产母猪在配种前喂给，能得到较好的效果。如有一定抗体的母猪在怀孕80天以后再作补充喂饲，则可产生较高免疫水平，并通过初乳传递给仔猪。这种方法不仅对防制本病、保护胎猪和吮乳猪的健康有效，而且对其他肠道病毒引起的繁殖障碍也有较好的效果。但使用本法要十分慎重，如果场内有小猪会造成人工感染。

药物预防：预防性投药和治疗，对控制细菌源性的混合感染或继发感染，是非常可取的。但是至今PCV2引起相关猪病的病原和机制尚未完全了解，因此还不能完全依赖特异性防制措施，只能同时开展有效的综合性措施，才能收到事半功倍的效果。

以下药物预防方案可以试用。

仔猪用药：哺乳仔猪在3、7、21日龄注射3次得米先（长效土霉素，200mg/ml，每次0.5ml），或者在1、7日龄和断奶时各注射速解灵（头孢噻呋，500mg/ml）0.2ml；断奶前1周至断奶后1个月，用支原净（50mg/kg）+金霉素或土霉素或强力霉素（150mg/kg）拌料饲喂，同时用阿莫西林（500mg/L）饮水。

母猪用药：母猪在产前1周和产后1周，饲料中添加支原净（100mg/kg）+金霉素或土霉素（300mg/kg）。

综合防制计划如下。

分娩期：仔猪全进全出，两批猪之间要清扫消毒；分娩前要清洗母猪和治疗寄生虫；限制交叉哺乳，如果确实需要也应限制在分娩后24h以内。

断乳期：猪圈小，原则上一窝一圈，猪圈分隔坚固；坚持严格的全进全出，并有与邻舍分割的独立粪尿排出系统；降低饲养密度（>0.33m2/头猪）；增加喂料器空间（>7cm/只仔猪）；改善空气质量（NH3<10×10－6，CO2<0.1%），相对湿度<85%。猪舍温度控制和调整：3周龄仔猪为28℃，每隔1周调低2℃，直至常温；批与批之间不混群。

生长育肥期：猪圈小，壁式分隔；坚持严格的全进全出、空栏、清洗和消毒制度；从断奶后猪圈移出的猪不混群；整个育肥圈猪不再混群；降低饲养密度（>0.75m2/头猪）；改善空气质量和温度。

其他：适宜的疫苗接种计划；保育舍要有独立的饮水加药设施；严格的保健措施（断尾、断齿、注射时严格消毒）；将病猪及早移到治疗室或扑杀。

防治措施如下。

实验兽医生物安全措施：认真地对待引种工作，引种不慎往往是暴发疫情的主要原因。引进的后备母猪应进行严格的检疫，所购买的种公猪、精液必须无圆环病毒Ⅱ型感染。

改进饲养管理，减少应激，合理配制日粮。注意通风与保暖，保持猪舍干燥，改善猪舍的空气质量，降低氨气浓度。去势和注射须遵循良好的卫生和消毒习惯。

在猪场内禁养猫、犬，定期驱蚊蝇、投饵灭鼠。搞好种猪群的净化，坚持自繁自养。定期监测，合理制订免疫程序，避免过早或过多地对仔猪免疫，减少各种应激因素对仔猪的影响。

在猪圆环病毒Ⅱ型易感期最好不注射应激较大的疫苗，如仔猪副伤寒疫苗、口蹄疫疫苗、气喘病疫苗等，某些可以靠药物预防的细菌性传染病，如猪丹毒、猪肺疫、猪链球菌病、仔猪副伤寒等，可以暂停疫苗注射。

（六）实验室检测

猪圆环病毒Ⅱ型阻断ELISA抗体检测方法。

依据标准：GB/T 35910—2018。

1.仪器、材料与试剂

（1）试验仪器　酶联免疫检测仪、高速台式冷冻离心机、微量移液器。

（2）试验材料　96孔酶标反应板、注射器、微量离心管（1.5ml）、吸头。

（3）主要试剂　PCV2重组核衣壳蛋白（Cap）抗原（见附录A）、辣根过氧化物酶（HRP）标记的PCV2单克隆抗体、PCV2阳性对照血清和阴性对照血清（见附录A）、四甲基联苯胺（TMB）（见附录B）、商品化PCV2 ELISA抗体检测试剂盒。

2.PCV2抗体阻断ELISA检测方法

（1）样品采集、运输与保存处理

1）样品的采集与运送　采用消毒注射器经猪颈静脉采集血液2ml，凝固后24h内在冷藏条件下运送到实验室。若不能及时送往实验室，则应分离血清，放入无菌微量离心管中置－20℃保存，并在冻结状态下送往实验室。

2）血清分离与保存　取凝固血液，2000r/min离心5min，收集上清，放入无菌微量离心管中，立即用于抗体检测，或置－20℃保存。要求血清清亮，无溶血。

（2）ELISA操作步骤

1）抗原包被板的制备

① 抗原包被板　用抗原包被液（见附录B）将PCV2 Cap蛋白（见附录A）稀释成2.0μg/ml，加入96孔酶标反应板，每孔100μl，置37℃ 2h。

② 洗涤　倾去孔中液体，用PBST洗涤液（见附录B）洗涤，每孔300μl，洗涤3次，每次3min，最后一次拍干。

③ 封闭　每孔加入200μl 1%BSA（牛血清白蛋白）封闭液（见附录B），置37℃孵育3h。

④ 加保护剂　弃去孔中液体，洗涤3次，加入抗原保护剂（见附录B），100μl/孔，置37℃下作用1h。

⑤ 密封　置37℃晾干，用锡箔纸真空包装，密封。

2）血清样品稀释和加样　取出抗原包被板并在记录表上标记待检样品（YP1-YPn）的位置。用血清稀释液（见附录B）在稀释板内将待检血清1∶1稀释，即每孔先加50μl样品稀释液，再加50μl待检血清，混匀后，按记录表中标记的对应于抗原包被板的位序，依次加入YP1、YP2、YP3……位置的各孔中，吸取每份血清时均应更换吸头。

待检血清样品数量较多时（≥10份），应先使用血清稀释板稀释所有待检血清，再将稀释好的血清转移到抗原包被板，以尽可能使反应时间一致。

3）加对照血清　用血清稀释液将阳性对照血清（见附录A）、阴性对照血清（见附录A）分别做1∶1稀释后，各取100μl阴性对照血清分别加入A1孔和A2孔，各取100μl阳性对照血清分别加入B1孔和B2孔。吸取不同血清时需更换吸头。

4）混合孵育　轻轻振荡微量反应板，用封条封闭，置37℃孵育2h。

5）洗涤　同1）。

6）加酶标单抗和孵育　每孔加入100μl工作浓度的HRP标记的PCV2单克隆抗体，37℃孵育30min。该试剂使用前恢复至室温，使用后放回2～8℃。

7）洗涤　同1）中第②步。

8）显色　每孔加入100μl TMB底物液显示液（见附录B），37℃避光孵育10～15min，至阴性对照显蓝色、阳性对照基本不显色时，每孔加入50μl终止液（见附录B）。

9）读数　在酶联免疫检测仪450nm波长处读取各孔的OD值数，15min内完成。

（3）结果判定

1）结果计算

阴性对照平均OD值（NCX）见式（1-6）：

NCX=（A1孔OD值+A2孔OD值）/2　　 （1-6）

阳性对照平均OD值（PCX）见式（1-7）：

PCX=（B1孔OD值+B2孔OD值）/2　　 （1-7）

样品阻断率的计算方式见式（1-8）：

阻断率（PI）=（NCX－样品OD值）/NCX×100%　　 （1-8）

2）判定　NCX大于0.7、PCX小于0.4时，试验成立。当PI≥38%判为阳性，PI≤30%判为阴性，30%<PI<38%判为可疑，对可疑样品应重新检测1次，PI<38%，判为阴性。

附录A

（规范性附录）

抗原抗体的制备

A.1　重组Cap抗原制备

A.1.1　菌种

表达抗原蛋白的菌种为BL21-CapC，由含PCV2 Cap第51～234aa基因原核表达质粒pET-CapC转化大肠杆菌BL21（DE3）获得。

A.1.2　菌液培养

取BL21-CapC种子液按培养基体积1%量接种于含卡那霉素的LB液体培养基中200r/min，37℃摇床振荡培养，1.5～2h，菌液浓度OD600nm值达到0.6～0.8时，加入IPTG至终浓度1.0mmol/L，37℃振荡培养6h。

A.1.3　菌体裂解与包涵体蛋白提取

将A.1.2收集的细菌样品4℃8000r/min离心5min，PBS缓冲液重悬，如此洗涤2次；弃上清，用适量PBS重悬细菌沉淀，并反复冻融3次；在功率200W的条件下超声波裂解细菌，超声裂解5s，停顿5s，直至菌液变得清澈，在冰盒上操作；将上述裂解物4℃8000r/min离心10min，沉淀用与上清等体积的PBS重悬。8000r/min离心15min，包涵体洗液Ⅱ（见附录B）重悬沉淀，4℃2h，重复1次；8000r/min离心15min，用8mol/L尿素重悬沉淀，4℃放置12～24h；8000r/min离心15min，吸取上清（即纯化后的蛋白）至微量离心管，分光光度计测定蛋白浓度，分装，－20℃保存。

A.1.4　重组抗原质量检验

A.1.4.1　抗原纯度鉴定

取A.1.3收集的样品，加入25μl的5×蛋白样品上样缓冲液，充分混匀后100℃煮沸5min，立即置冰上1～2min，上样前瞬时离心，吸取上清，用12%的丙烯酰胺SDS-PAGE分析，在41kDa处出现一条清晰条带，抗原纯度达90%以上。

A.1.4.2　蛋白抗原性鉴定

取上述收集的样品20μl，按A.1.4.1方法进行SDS-PAGE电泳。然后25V恒压下，转印45min，使目的条带转印至NC膜上。用PBST洗涤液配制的5%的脱脂乳封闭2h，PBST洗涤后，加适量稀释的PCV2 Cap单克隆抗体，作用1h PBST洗涤，再加1∶20000稀释的羊抗鼠IgG-HRP作用1h，洗涤后加显色液于暗室曝光，应在4kDa处出现单一清晰条带，且无其他杂带。

A.1.4.3　抗原浓度的测定

用紫外分光光度计，分别测定包被抗原在280nm和260nm波长时的吸光度（OD），按公式1.45×OD280nm－0.74×OD260nm计算抗原浓度，浓度不低于0.5mg/ml。

A.1.4.4　抗原免疫学活性鉴定

采用ELISA方法测定。用抗原包被液将纯化的蛋白从1.0μg/ml稀释至0.2μg/ml，包被ELISA酶标板，进行ELISA检测。选择阳性对照血清的S/P值高于阳性判定标准时的抗原最高稀释倍数作为抗原包被浓度。抗原效价应大于0.25μg/ml。

A.1.5　分装及保存

将检测合格的抗原分装到1.5ml微量离心管中，分装量为1ml/管，置－70℃下保存，有效期为12个月。避免反复冻融和污染。

A.2　PCV2阳性和隐形血清制备

A.2.1　阳性对照血清

A.2.1.1　血清来源动物

4～6周龄健康仔猪，隔离观察7d。

A.2.1.2　免疫接种

取PCV2 SH株病毒液，颈部肌内注射2ml/头，间隔28d用相同剂量PCV2再次肌注接种，第二次接种后20～40d采血分离血清，用PCV2间接免疫荧光试验检测PCV2抗体，抗体效价大于1∶64时，即可用于采血并分离血清。

A.2.1.3　血清制备

采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用0.45μm滤膜过滤除菌。用PCV2间接免疫荧光试验检测PCV2抗体，应为阳性。用阻断ELISA方法检测PCV2 ELISA抗体，阻断率均应大于60%，OD450nm值应低于0.4。

A.2.1.4　血清保存

置－70℃以下保存，避免反复冻融和污染，有效期24个月。

A.2.2　阴性对照血清

A.2.2.1　血清来源动物

同A.2.1.1。

A.2.2.2　血清制备

采取颈部动脉采血方式，无菌采集血液，离心分离血清，用0.45μm滤膜过滤除菌。用PCV2间接免疫荧光试验检测PCV2抗体，应为阴性。用阻断ELISA方法检测PCV2 ELISA抗体，阻断率均应大于30%，OD450nm值应大于0.7。

A.2.2.3　血清保存

同A.2.1.4。

附录B

（规范性附录）

溶液的配制

B.1　抗原包被液（pH9.6，0.05mol/L）

称取Na2CO31.59g、NaHCO32.93g，加去离子水800ml，用1mol/L NaOH和1mol/L的HCl调pH值至9.6，加去离子水定容至1000ml。

B.2　封闭液

称取BSA1g，溶解于100ml PBST洗涤液中，0.22μm滤膜过滤，分装后4℃保存。

B.3　保护剂

称取BSA0.5g、蔗糖2g，加去离子水溶解并定容至100ml，0.22μm滤膜过滤，分装后2～8℃备用。

B.4　样品稀释液

取NaCl 8g、KH2PO4·2H2O 2g、Na2HPO4·2H2O 2.9g、KCl 0.2g和吐温-20 0.5ml，溶于灭菌去离子水中，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤，分装，20ml/瓶。2～8℃下保存。

B.5　10倍浓缩洗涤液

取NaCl 8g、KH2PO4·2H2O 2g、Na2HPO4·12H2O 29g、KCl 2g和吐温-20 5ml，加入灭菌去离子水充分溶解，定容至1000ml，0.22μm滤膜过滤，分装，80ml/瓶。2～8℃下保存。

PBST洗涤液配制：将10倍浓缩洗涤液恢复至室温，并摇动使其溶解，然后用去离子水作10倍稀释，混匀，稀释好的洗涤液在2～8℃下可存放7d。

B.6　显色液

A液配制：取Na2HPO414.6g、柠檬酸9.33g、30%H2O2 2ml，加双蒸水至1000ml，调pH至5.2。

B液配制：取四甲基联苯胺20mg、无水乙醇10ml，加双蒸水至1000ml。

使用前A液和B液等量混合，分装于棕色瓶内，20ml/瓶。2～8℃下保存。

B.7　终止液

取去离子水177.8ml，缓慢加入H2SO4 22.2ml，分装，10ml/瓶。2～8℃下保存。

B.8　包涵体洗液Ⅰ（pH8.0）

取Tris·HCl 6g、NaCl 5.8g、EDTA 2.92g、Triton-X-100 10ml，用去离子水加至1000ml。

B.9　包涵体洗液Ⅱ（pH8.0）

取Tris·HCl 6g、NaCl 5.8g、EDTA 2.92g、Triton-X-100 5ml，用去离子水加至1000ml。