第二节　猪　病

一、猪瘟

猪瘟俗称烂肠瘟，美国称猪霍乱，英国称为猪热病，是由猪瘟病毒引起猪的急性、热性、败血性和高度接触性传染病。根据临诊症状可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、温和型、繁殖障碍型、神经型7种。最急性型特征是发病急、高热稽留和全身性小点出血，脾梗死；急性型呈败血性变化，实质器官出血、坏死；亚急性型和慢性型不但有不同程度的败血性变化，且还发生纤维素性、坏死性肠炎；繁殖障碍型、温和型、神经型引起母猪带毒综合征，导致孕猪流产、早产，产死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔猪先天性头部震颤和四肢颤抖等。本病是猪的一种重要传染病，OIE将其列入A类动物疫病，我国将其列为一类动物疫病。

目前，本病在亚洲、非洲、中南美洲仍然不断发生，在美国、加拿大、澳大利亚及欧洲若干国家已经被消灭，但在欧洲某些国家近10年来仍有发病的报道。

（一）病毒特征

猪瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV；美国称为 Hog cholera virus，HCV）属于黄病毒科（Flaviviridae）瘟病毒属（Pestivirus），是世界范围内最重要的猪病病毒。基因组为单链正股RNA，病毒粒子呈球形，直径为38～50mm，具有脂蛋白囊膜和20面体立体对称的核衣壳。目前认为猪瘟病毒仅有一个血清型，但病毒株的毒力有强、中、弱之分。猪瘟病毒与牛病毒性腹泻/黏膜病病毒（BVD）的基因组序列有高度的同源性，抗原关系密切，既有血清学交叉反应，又有交叉保护作用，猪能自然感染这种病毒。用BVDV抗血清与猪瘟病毒株作中和试验，可将猪瘟病毒分为H群（强毒株）和B群（弱毒株）。猪瘟野毒株的毒力变化很大，H群不能被BVDV抗血清中和，可引发急性发病和高病死率；B群能被BVDV抗血清中和，一般引起亚急性或慢性传染。

猪瘟病毒分布于病猪全身体液和各种组织内，以淋巴结、脾和血液中含量最高，每克含数百万个猪最小感染量。病猪的尿、粪便等排泄物和分泌物都含有大量病毒，发热期含病毒量最高。猪瘟病毒对环境的抵抗力不强，温度越高越敏感，但存活的时间取决于含毒的介质。正常条件下，76℃经1h可使病毒失去感染力；在干燥条件下，病毒容易死亡，被污染的环境在干燥和阳光直射的条件下，经1～4周可失去传染性。猪瘟病毒在冷藏猪肉中可存活几个月，在冰冻猪肉中存活时间可达数年之久，在浓度高达174%的盐腌制猪腿肉中尚能存活102d，这些具有重要的流行病学意义。对乙醚、氯仿、β-丙烯内酯和碱性消毒药物敏感，如2%氢氧化钠、生石灰等。1%的福尔马林、碳酸钠（4%无水或10%结晶碳酸钠+0.1%去污剂）、离子和无离子去污剂等能将其灭活。

（二）临床症状

本病的潜伏期一般5～7d，最短2d，长的21d。根据病程长短和临诊症状可分为最急性型、急性型、亚急性型、慢性型、繁殖障碍型、温和型和神经型。

最急性型：多见于流行初期，主要表现为突然发病，高热稽留，体温可达41℃以上，全身痉挛，四肢抽搐，皮肤和可视黏膜发绀、有出血点，倒卧地上很快死亡，病程1～5d。

急性型：体温升高到41～42℃，稽留不退，精神沉郁，行动缓慢、低头垂尾、嗜睡、发抖，行走时拱背、不食。病猪早期有急性结膜炎，眼结膜潮红，眼角有多量脓性分泌物，甚至使眼睑粘连；口腔黏膜发绀、有出血点。公猪包皮内积尿，用手可挤出浑浊恶臭尿液。病初出现便秘，排出球状并带有血丝或伪膜的粪球，随病程的发展呈现腹泻或腹泻便秘交替出现。皮肤初期潮红充血，随后在耳、颈、腹部、四肢内侧出现出血点和出血斑（图1-41）。濒死前，体温降至常温以下，病程一般1～2周。

亚急性型：症状与急性型相似，但较缓和，病程一般3～4周。不死亡者常转为慢性型。

慢性型：主要表现消瘦，全身衰弱，体温时高时低，便秘腹交替，被毛枯燥，行走无力，食欲不佳，贫血。有的病猪在耳端、尾尖及四肢皮肤上有紫斑或坏死，病程1个月以上。病猪很难恢复，不死者长期发育不良，形成僵猪。

繁殖障碍型（母猪带毒综合征）：有的孕猪感染后可不发病但长期带毒，并能通过胎盘传给胎儿。有的孕猪出现流产、早产，产死胎、木乃伊胎、弱仔或新生仔猪先天性头部、四肢颤抖，一般数天后死亡，存活的仔猪可出现长期病毒血症。

温和型：症状较轻且不典型，有的耳部皮肤坏死，俗称干耳朵；有的尾部坏死，俗称干尾巴；有的四肢末端坏死，俗称紫斑蹄。病猪发育停滞，后期四肢瘫痪，不能站立，部分病猪跗关节肿大。病程一般半个月以上，有的经2～3个月后才能逐渐康复。

神经型：多见于幼猪。病猪表现为全身痉挛或不能站立，或盲目奔跑，或倒地痉挛，常在短期内死亡。

（三）病理变化

根据病程长短和继发感染情况，病理变化有所不同。

最急性型：多无明显病理变化，一般仅见到黏膜、浆膜和内脏有少数点状出血，淋巴结轻度肿胀和出血。

急性型：主要表现为典型的败血症病变，全身皮肤、浆膜和内脏实质器官有不同程度的出血变化，以淋巴结、肾脏、膀胱、喉头、会厌软骨和大肠黏膜的出血最为常见。皮肤出血主要见于耳根、腹下和四肢内侧。心肌、肺脏、输尿管等处有数量不等的出血点或出血斑。两侧扁桃体坏死。全身淋巴结肿大、多汁、充血和出血，呈暗红色，切面呈弥漫性出血或周边出血，中心部保持有灰白色区域，呈红白相间的大理石状花纹；脾不肿大，色泽基本正常，边缘及尖端有大小不一、紫红色、隆起的出血性或贫血性梗死灶，呈结节状（图1-42）。这是猪瘟最有诊断意义的病变。

肾脏色泽变淡，呈土黄色，皮质部有针尖大到小米粒大数量不等的出血点，少者数个，多者密布，髓质出血比较少见，仔猪先天感染表现“有沟肾”。胃浆膜、黏膜出血，小肠有卡他性炎症，回肠、盲肠（特别是回盲瓣处）和结肠常有特征性的坏死、溃烂，形成纽扣状溃疡（图1-43）。

膀胱出血明显，膀胱黏膜上密布有针头大小的出血点。

亚急性型：全身出血性症状较急性型轻，但坏死性肠炎和肺炎变化明显。

慢性型：主要变化为坏死性肠炎，全身出血变化不明显。特征性病变是在盲肠、回盲口及结肠黏膜上形成纽扣状溃疡，呈同心轮层状纤维素性坏死，黑褐色突出于肠黏膜表面。肋骨病变也很常见，表现为突然钙化，从肋骨、肋软骨联合到肋骨近端有半硬的骨结构形成的明显横切线。繁殖障碍型、温和型和神经型的剖检病变特征不明显。

（四）流行病学特征

易感动物：本病在自然条件下只感染猪。不同品种、年龄、性别的猪均可感染发病。

传染源：病猪和隐性感染的带毒猪为主要传染源。猪感染猪瘟病毒后1～2d，未出现临诊症状前即可向外界排毒；病猪痊愈后仍可带毒和排毒5～6周；病猪的排泄物、分泌物和屠宰时的血、肉、内脏和废料、废水都含有大量病毒；被猪瘟病毒污染的饲料、饮水、用具物品、人员、环境等也是传染源。随意抛弃病死猪的肉尸、脏器或者病猪、隐性感染猪及其产品处理不当均可传播本病。带毒母猪产出的仔猪可持续排毒，也可成为传染源。猪场内的蚯蚓和猪体内的肺丝虫是自然界的保毒者，应引起重视。

传播途径：猪瘟主要通过直接或间接接触方式传播，一般经消化道传染，也可经呼吸道、眼结膜感染或通过损伤的皮肤、阉割时的创口感染。非易感动物和人可能是病毒的机械传递者。

妊娠母猪感染猪瘟后，病毒可经胎盘垂直感染胎儿，产出弱仔、死胎、木乃伊胎等，分娩时排出大量病毒。如果这种先天感染的仔猪在出生时正常并存活几个月，它们便成为病毒散布的持续感染来源，这种持续的先天性感染对猪瘟的流行病学研究具有极其重要的意义，试验证明，母猪在妊娠40日龄感染则发生死胎、木乃伊胎和流产；70日龄感染者所生的仔猪45%带毒，出生后出现先天性震颤，多于1周左右死亡；90日龄感染者所生的仔猪可存活2～11个月，此种猪无明显症状但终身带毒、排毒，为猪瘟病毒的主要储存宿主，有这些猪的存在即可形成猪瘟常发地区或猪场。

流行因素及形式：本病一年四季均可发生，一般以深秋、冬季、早春较为严重。急性暴发时，先是几头猪发病，突然死亡，继而病猪数量不断增加，多数呈急性经过并死亡，3周后逐渐趋于低潮，病猪多呈亚急性型或慢性型，如无继发感染，少数慢性病猪在1个月左右康复或死亡，流行终止。

近年来猪瘟流行发生了变化，出现非典型猪瘟、温和型猪瘟，均以散发性流行。发病特点不突出，临诊症状较轻或不明显，病死率低，无特征性病理变化，必须依赖实验室诊断才能确诊。

（五）预防及治疗

本病坚持“预防为主”，采取综合性防控措施。

（1）免疫接种　这是当前防控猪瘟的主要手段。一般情况下，用细胞苗免疫时，仔猪25日龄左右进行第1次免疫接种，60日龄再进行第2次免疫接种。猪瘟流行严重的猪场可采取超前免疫的办法，即在仔猪刚出生后未吃初乳前，接种猪瘟疫苗1～2头份，注苗1～2h后再自由哺乳，于70日龄进行第2次免疫。实施超前免疫时，母猪分娩过程中必须有专人守护，随生随免，吃到初乳后再免疫接种将失去效果。超前免疫中个别仔猪会出现过敏反应（全身出现青紫色，呼吸急速，呕吐，站立不稳，随后倒地，呈昏迷状态），可注射地塞米松酸钠液或苯海拉明、肾上腺素等进行抢救。

在上述免疫的基础上，种猪每半年加强免疫一次，种母猪应于配种前25d免疫一次，使之产生坚强的免疫力，避免妊娠期间感染猪瘟。

为确保免疫效果，可适当加大免疫剂量或改猪瘟细胞苗为兔化猪瘟组织苗。根据多数学者实践中应用的情况，适当提高免疫剂量可提高抗体水平。以下剂量供参考：种猪4～5头份，仔猪2～3头份，仔猪母源抗体在1∶32以上时（25日龄左右）4头份较好。曾经出现免疫失败的猪场，尤其是有繁殖障碍型、温和型和神经型猪瘟存在的情况下，可选用猪瘟脾淋组织疫苗进行免疫，效果较好。

（2）开展免疫监测　有条件的猪场应开展免疫监测（可用酶联免疫吸附试验或间接血凝试验），根据母源抗体水平或残留抗体水平适时免疫。并于每次免疫接种后进行免疫效果监测，凡是接种后抗体水平不合格的猪，再免疫一次，仍不合格者属免疫耐受猪，应坚决淘汰。

（3）及时淘汰隐性感染带毒猪　应用直接免疫荧光抗体试验检测种猪群，只要检查出阳性带毒猪，坚决扑杀，进行无害化处理，消灭传染源，降低垂直传播的危险，建立一个健康状态良好的种猪群。

（4）加强检疫，防止引入病猪　实行自繁自养，尽可能不从外地引进新猪。必须由外地引进猪时，应到无病地区选购，并做好免疫接种；回场后，应隔离观察2～3周，并应用免疫荧光抗体试验或酶标免疫组织抗原定位法检疫。确认健康无病方可混群饲养。

（5）建立“全进全出”的管理制度，消除连续感染、交叉感染。

（6）做好猪场、猪舍的隔离、卫生、消毒工作　禁止场外人员、车辆、物品等进入生产区，必须进入生产区的人员应经严格消毒，更换工作衣、鞋后方可进入；进入生产区的车辆物品也必须进行严格消毒；生产区工作人员应坚守工作岗位，严禁串岗；各猪舍用具要固定，不可混用；生产区、猪舍要经常清扫、消毒，认真做好驱虫、灭鼠工作。

（7）加强市场、运输检疫，控制传染源流动，防止传播猪瘟。

（8）科学饲养管理，提高机体抵抗力。

（六）实验室检测

参照标准：GB/T 16551—2008。

1.病原学诊断

（1）兔体交互免疫试验

1）样品处理　将病猪的淋巴结、脾脏和肾脏磨碎后用无热原性的生理盐水做1∶10稀释。

2）接种家兔　将上述处理的样品肌内注射三只健康家兔，每只5ml，另设三只不注射病料而仅注射生理盐水的对照兔，24h后，每隔6h测体温一次，连续测温5d。

3）接种家兔　接种样品5d后对所有家兔静脉注射用无热源性的生理盐水稀释成1ml含有100个兔体最小感染量的猪瘟兔化弱毒（淋巴、脾脏毒），每只1ml，同时增设两只仅注射猪瘟兔化弱毒的对照兔。24h后，每隔6h测体温一次，连续测96h，注射生理盐水和仅注射猪瘟兔化弱毒的两组对照兔分别2/3和2/2出现定型热或轻型热时，试验成立。

4）判定标准　猪瘟强毒不引起家兔体温反应，但能使其产生免疫力，从而降低猪瘟兔化弱毒苗的攻击。因此，可以利用猪瘟兔化弱毒攻击后是否出现体温反应作指标，以判定第一次接种的病料中是否含有猪瘟病毒。试验组的试验结果判定见表1-10。

（2）免疫酶染色试验

1）样品的采集　解剖检查时采病猪扁桃体、脾、肾、淋巴结作压印片或冰冻切片，同时设正常组织对照标本。标本自然干燥后，在2%戊二醛和甲醛等量混合液中固定10min，干燥后，置冰箱内待检。

2）操作程序

① 将标本浸入0.01%过氧化氢或0.01%叠氮钠的Tris-HCl缓冲液中，室温下作用30min。

② 用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水漂洗5次，每次3min，风干。

③ 将标本置于湿盒内，滴加1∶10酶标记抗体，覆盖标本面上，置37℃作用45min。

④ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水-1%吐温缓冲液漂洗5次，每次2～3min。

⑤ 将标本放入DAB（4-二甲氨基偶氮苯）Tris-HCl液内，置37℃作用3min。

⑥ 用pH7.4的0.02mol/L磷酸缓冲盐水冲洗5次，每次2～3min，再用无水酒精、二甲苯脱水，封片检查。

⑦ 用普通生物显微镜检查判定结果，如细胞质染成深褐色为阳性，黄色或无色为阴性，正常对照标本应为阴性。猪瘟兔化弱毒接种的猪组织细胞质呈微褐色，与强毒株感染有明显区别。

（3）病毒分离与鉴定试验

1）将2g扁桃体或脾脏或肾脏剪成小块，加上灭菌砂在研钵中研成匀浆，用Hank’s液或MEM配成20%悬液，加青霉素（使最终浓度为500U/ml）和链霉素（使最终浓度为500μg/ml），室温下放置1h，以3000r/min离心15min取上清液。

2）将PK15单层细胞用胰酶消化分散后，以8000r/min离心10min，用不含牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的5%胎牛血清的MEM配成每毫升含2×106个细胞的悬液。

3）九份细胞悬液加一份病料悬液接种于带有细胞飞片的转瓶或微量细胞培养板。另设不加病料的对照若干瓶（孔），于接种后1d、2d、3d，分别从两个接种瓶（孔）和一个对照瓶（孔）中取出细胞片用Hank’s液或MEM洗涤两次，每次5min，用冷无水丙酮固定10min。

4）按（2）或（4）、5）～（4）、7）进行免疫酶染色或荧光抗体染色、镜检并判定结果。

（4）直接免疫荧光抗体试验

1）采样　群体检疫中，待检可疑猪不少于3例，其中至少2例为早期患猪，活体取扁桃体或剖杀后摘取扁桃体。后期病猪剖杀后采扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏。个体检疫时，可活体取扁桃体或剖杀可疑猪采扁桃体、淋巴结、脾脏、肾脏。所采组织样品应新鲜且为猪瘟疫苗免疫21d后。

2）送检　采样后应尽快冷藏送检，如当日不能送出，应冻结保存，避免组织腐败、自溶，影响结果。

3）制片　将样品组织块切出1cm×1cm的小块，不经任何固定处理，直接冻贴于冰冻切片机的冰冻切片托上（组织块太小时，如活体采取的扁桃体，可用冰冻切片机专用的包埋剂或化学浆糊包埋），进行切片，切片厚度要求5～7μm。将切片展贴在0.8～1.0mm厚的洁净载玻片上，也可将样片组织直接作压片或涂片，同时设正常对照片。

4）固定　将切片、压印片或涂片置无水丙酮中固定15min。取出立即放入0.01mol/L、pH7.2的磷酸缓冲盐水中，轻轻漂洗3次。取出，自然干燥后，尽快进行荧光抗体染色。

5）荧光抗体染色　将猪瘟荧光抗体滴加于样品片表面，放置湿盒内于37℃作用30min。取出后浸入磷酸缓冲盐水中充分漂洗，再用带有0.5mol/L，pH9.0～9.3碳酸盐缓冲甘油的盖玻片（0.17mm厚）封固样品片表面。染色后应尽快镜检，4℃保存不应超过72h。必要时可低温保存待检，但也不应超过1周。

6）镜检　将染色、封固后的样品片置于激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。

7）判定标准　于荧光显微镜视野中，见扁桃体隐窝上皮细胞或肾曲小管上皮细胞浆内呈现明亮的黄绿色荧光，或脾、淋巴结胞浆内有黄绿色荧光判为猪瘟病毒感染阳性。正常对照片细胞内应无黄绿色荧光。

（5）猪瘟病毒反转录聚合酶链反应（RT-PCR）

1）材料与样品准备

① 材料准备：本试验所用试剂需用无RNA酶污染的容器分装；各种离心管和带滤芯吸头须无RNA酶污染；剪刀、镊子和研磨器应干烤灭菌。

② 样品制备：按1∶5比例，取待检组织和MEM液于研钵中充分研磨制成匀浆液，4℃，以1000g离心15min，取上清液转入无RNA酶污染的离心管中备用；采全血脱纤抗凝备用；细胞培养物冻融3次备用；其他样品酌情处理。制备的样品在2～8℃保存应不超过24h，长期保存小瓶分装后置－70℃以下，避免反复冻融。同时设立阴、阳性对照。

2）RNA提取

① 移取750μl Trizol至1.5ml Eppendorf管，加入200μl血液（培养液或组织处理上清），旋涡振荡20s，室温下作用5min，加入200μl三氯甲烷，旋涡振荡15s，室温下作用10min。

② 以12000r/min（11750g）、4℃离心15min。

③ 轻轻吸取上清转至新的1.5ml Eppendorf管（注意不要吸到中间蛋白层），550～600μl，加入等量预冷的异丙醇，颠倒数次混匀，－20℃条件下静置至少10min。

④ 以12000r/min（11750g）、4℃离心15min。

⑤ 轻轻倒掉上清，顺势将管口残液在吸水纸上蘸干（注意各管不要用吸水纸同一点），向管中轻加入1ml预冷的75%乙醇。轻轻颠倒数次，将乙醇倒掉，将管口残液在水纸上蘸干（注意各管不要用吸水纸同一点），盖上后，以5000r/min、4℃离心2min。

⑥ 用洁净无酶吸头将管底乙醇吸干，注意不要吸走沉淀（RNA少的情况下可能看不见沉淀）。在安全柜或超净台中将残留的乙醇吹干，约5min，直至无乙醇味为止。时间不要太长，以免RNA溶解困难。

⑦ 用下列比例配制溶液溶解RNA：

4μl 0.1mol/L MDTT

1μl RNA酶抑制剂（Rnase inhibitor）

15μl无酶水

共计20μl，按此比例一次性配好，混匀。按每个样品20～50μl配制。

吸取20～50μl RNA溶解液溶液加至 Eppendorf管底，55～65℃水浴助溶10min。RNA溶液在－80℃保存。短期也可在－20℃保存。

3）cDNA合成

① 吸取5μl上述RNA溶液至PCR管中。

② 加入1μl 50 pmol/L的下游引物，68℃作用5min，冰水浴中降温（或在PCR仪中采用程序：68℃反应5min，置于4℃结束反应）。

③ 加入下列试剂：

2μl 5×第一链缓冲液（first strand buffer）

0.5μl 0.1mol/L DTT

0.5 μl DNTP（10 mmol/L）

0.25μlRNA酶抑制剂（Rnase inhibitor）

0.5μl反转录酶（superscript）

PCR仪中50℃反应60min，75℃温育10min，置于4℃结束反应。

4）PCR

① 吸取上述cDNA模板3μl，无酶水34.5μl。

② 加入下列试剂：

5μl 10×PCR缓冲液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl上游引物

1μl下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增，条件如下：94℃预热3min，94℃变性50s，58℃退火50s，72℃链延伸1min40s，30个循环；72℃温育10min，置于4℃结束反应。

5）nest-pcr

① 吸取上述PCR模板1.5μl，无酶水36μl。

② 加入下列试剂：

5μl 10×PCR缓冲液

3μl DNTP（10m mol/L）

1μl nest上游引物

1μl nest下游引物

2.5μl TaqDNA聚合酶

将混合物吹打均匀后，至PCR仪中扩增，条件如下：94℃预热3min，94℃变性50s，54℃退火50s，72℃链延伸1min 40s，30个循环；72℃温育10min，置于4℃结束反应。

6）电泳　取6～10μl PCR产物在0.8%琼脂糖凝胶中进行电泳，缓冲液为0.5×TBE，100V、40min。

7）凝胶成像及结果判定　阳性样品出现1.2k大小条带、阴性样品无条带出现时，试验成立。被检样品出现1.2k大小条带为猪瘟阳性，否则为阴性。

2.血清学诊断

（1）荧光抗体病毒中和试验

1）细胞准备

① 将浓度为每毫升含2×105个细胞的PK15细胞悬液接种于带有盖玻片的Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板中。

② 于37℃二氧化碳培养箱中培养1～2d，直至有70%～80%的细胞形成单层，Leighton管可用普通培养箱培养。

2）病毒中和试验

① 被检血清于56℃灭活30min，在国际贸易中，最好作1∶5稀释。在国内作抗体水平普查时，被检血清可作1∶25稀释。

② 将稀释的血清与含有200TCID50/0.1ml的病毒悬液等体积混合，置37℃作用1～2h。

3）中和后的病毒接种

① 将带有盖玻片的Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板，用无血清培养液洗涤3次后，用血清-病毒中和后的混合物接种在带有盖玻片的Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板上，置于37℃温箱作用1h，同时设置标准的阴、阳性血清中和对照，没有血清中和的病毒对照和正常细胞对照。

② 在Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板中加入细胞维持液，并将细胞培养物继续置于37℃温箱培养2d以上。

4）荧光抗体染色

① 从Leighton管、培养瓶或微量细胞培养板中取出带有细胞的盖玻片，用pH7.2的磷酸缓冲盐水洗涤细胞单层2次，每次5min，后用无水丙酮固定10min，再将工作浓度的猪瘟荧光抗体结合物滴加在带有细胞的盖玻片上，放置湿盒内，于37℃染色30min，并用pH7.2的磷酸盐缓冲盐水冲洗3次。

② 用pH9.0～9.3的90%碳酸盐-甘油缓冲液将盖玻片封固在无油渍的显微镜载玻片上，并在荧光显微镜下作荧光检查。

5）镜检　将染色、封固后的样品片置于激发光为蓝紫光或紫外光的荧光显微镜下观察。

6）判定标准

① 在荧光显微镜下，正常细胞对照和标准阳性血清中和对照的细胞胞浆中无黄绿色荧光，标准的阴性血清中和对照与没有血清中和的病毒对照的细胞胞浆中有黄绿色荧光时，试验成立，可判定被检样品的结果。

② 荧光显微镜下，被检样品的细胞质内未见黄绿色荧光时，判为猪瘟抗体阳性；被检样品的细胞质内有明亮的黄绿色荧光时，判为猪瘟抗体阴性。

（2）猪瘟单抗酶联免疫吸附试验

1）材料准备　猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原，酶标结合物，标准阴、阳性血清，酶联板及其他必要的试验溶液。

2）操作方法

① 抗原包被：用包被液将猪瘟弱毒单抗纯化酶联抗原、猪瘟强毒单抗纯化酶联抗原分别作100倍稀释，以每孔100μl分别加入做好标记的酶联板孔中，置于湿盒放4℃过夜。

② 洗涤：甩掉酶联板孔内的液体，加入洗涤液，室温下浸泡3min，甩去洗涤液，再重新加入洗涤液，连续洗涤3次，最后1次甩掉洗涤液后，拍干酶联板。

③ 加入被检血清：用稀释液将被检血清作400倍稀释，每孔加100μl。同时，将猪瘟标准阴、阳性血清以100倍稀释作对照，置湿盒于37℃作用1.5～2h，甩掉酶联板中稀释的血清，用洗涤液冲洗3次，洗涤方法同②。

④ 加入酶标抗体结合物：用稀释液将酶标抗体结合物作100倍稀释，每孔加入100μl，置湿盒于37℃孵育1.5～2.0h，甩掉酶标抗体结合物，用洗涤液冲洗3次，洗涤方法同②。

⑤ 加底物：每孔加入新配制的底物溶液（每块96孔酶联板所需底物溶液按邻苯二胺10mg加底物缓冲液10ml、30%过氧化氢37.50μl配制）100μl，室温下观察显色反应，一旦阴性对照孔略显微黄色，立即终止反应。

⑥ 终止反应：每孔加入终止液50μl后，迅速用酶联读数仪以490nm波长测定每孔的光吸收值（OD），并以阴性血清孔作为空白对照孔。

3）判定标准

① 在猪瘟弱毒酶联板上：

OD≥0.2，为猪瘟弱毒抗体阳性；

OD<0.2，为猪瘟弱毒抗体阴性。

② 在猪瘟强毒酶联板上：

OD≥0.5，为猪瘟强毒抗体阳性；

OD<0.5，为猪瘟强毒抗体阴性。

4）判定结论

① 同一份被检血清，当在猪瘟弱毒酶联板上结果为阳性，而在猪瘟强毒酶联板上结果为阴性时，表明被检猪为猪瘟疫苗免疫猪。

② 同一份被检血清当在猪瘟弱毒酶联板上结果均为阴性，而在猪瘟强毒酶联板上结果为阳性时，表明被检猪为猪瘟强毒抗体阳性猪疫苗免疫猪，该猪按（2）做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒猪。

③ 同一份被检血清，当在猪瘟弱毒和强毒酶联板上结果均为阳性时，表明被检猪为猪瘟强、弱毒抗体阳性猪，该猪按（2）做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒猪。

④ 同一份被检血清，当在猪瘟弱毒和强毒酶联板上结果均为阴性时，表明被检猪为猪瘟强、弱毒抗体阴性猪，该猪按（2）做猪瘟抗原检查，以确定是否为带毒的免疫猪或真正的猪瘟阴性猪。