第二章　生物化学实验

实验一　氨基酸纸色谱

一、实验目的

1.通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸色谱的基本原理及操作方法。

2.通过实验，理解氨基酸与茚三酮的显色反应原理，掌握显色反应现象。

二、实验原理

色谱法又称层析法，是一项重要的分离分析技术，利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。

根据色谱的工作原理可分为：分配色谱、吸附色谱、亲和色谱、离子交换色谱。根据色谱支持物的不同可分为：纸色谱、柱色谱、薄层色谱、凝胶过滤色谱。氨基酸的纸色谱属于分配色谱，其原理是利用各种物质在两种互不溶解的溶剂中分配系数的不同，从而达到分离的目的。分配色谱一般用于分离在水和有机溶剂中都有一定溶解度的混合物。

纸色谱的分配过程是一部分溶质随有机相（展层溶剂）移动，离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配（图2-1）。一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数，称为分配系数（K_D）。

由于各种物质的分配系数（K_D）不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移值（R_f）或迁移率表示：

对于水-正丁醇的溶剂体系，氨基酸极性越小，K_D值越大，R_f值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离越大，反之迁移距离越小。

三、器材和试剂

1.器材

展开槽，色谱滤纸（约15cm×15cm），电吹风机，喷雾器，毛细管，铅笔，针线，烘箱等。

2.试剂

（1）氨基酸标准液　6mg/mL。

（2）未知氨基酸溶液　6mg/mL。

（3）展层剂　水饱和正丁醇（或苯酚）溶液，即4份水饱和的正丁醇和1份醋酸的混合物。将20mL正丁醇和5mL醋酸放入分液漏斗中，与15mL水混合，充分振荡，静置后分层，放出下层水层。取扩展剂倒入培养皿中备用。

（4）显色剂　0.3%茚三酮丙酮溶液。

四、实验内容

1.色谱滤纸的准备

用铅笔在色谱滤纸上距离一端2～3cm处划直线（记为色谱底边点样线），在直线上标记标准氨基酸和未知氨基酸点样位置，并作上记号。

2.点样（少量多次）

用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.3cm，干燥后再点样，重复3次。注意样品点不要吹得太干燥，否则，样品物质的分子会牢牢吸附在色谱滤纸的纤维上，出现拖尾现象。

3.缝合成圆柱体（依据展开槽类型，选做）

小心将色谱滤纸沿垂直底边的两条边，以针线缝合，制成圆柱体（图2-2）。注意，缝合针线应靠近边缘，不可出现在氨基酸色谱点可能色谱经过的区域。

4.展层

将滤纸放入展开槽，使滤纸底边以下部分浸入液面，但不要使液面没过点样线。展层50～60min，取出滤纸，用铅笔绘出溶剂前沿线（图2-1）。

5.显色

将滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸点样线和溶剂前沿有效面上，吹干后放在80℃烘箱中烘干显色。

五、结果与分析

用铅笔描出色斑轮廓，找出中心点。如果斑点形状不规则或出现明显的“拖尾”，则圈出颜色集中均匀的部分。

观察记录标准品和样品氨基酸与茚三酮溶液反应后的颜色，测量色谱点和溶剂前沿距离，并计算各色斑的R_f值，对照氨基酸标准品，确定未知样品中氨基酸种类。

六、思考题

1. R_f值的概念。

2.如何计算R_f值？影响该值的因素有哪些？

3.纸色谱分离氨基酸的原理是什么？

4.分析造成色斑拖尾现象的原因。

七、注意事项

1.点样量要适当，点样要均匀。

2.尽可能不要用手去触摸滤纸有效面。

3.色谱分离时间根据色谱系统的具体情况而定，使分配系数相近的氨基酸分开。

4.喷茚三酮溶液时要均匀、适量，不可过多。