第八节　甲状腺髓样癌的突变与分子检测

甲状腺髓样癌（MTC）占甲状腺癌的4%。来自神经嵴来源的甲状腺滤泡旁C细胞，赋予它们的神经内分泌肿瘤如类癌和胰岛细胞瘤的临床及病理学特征；25%～30%的MTC发生在常染色体显性遗传疾病，这通常是双侧、多中心C细胞增生/降钙素生成性病变。遗传性MTC发生在较年轻的患者，常与其他内分泌肿瘤有关，通常出现在遗传综合征如MEN2和MENB。其余的MTC患者是散发的，比遗传性MTC年龄大，预后较差。组织学上，MTC由小多边形到梭形细胞排列成固体或骨小梁模式构成，常与淀粉样蛋白相关。MTC几乎总是发生在甲状腺侧叶，甲状腺的其他位置不常见。MTC周边的残余C细胞增生往往表明MTC是遗传的，虽然C细胞增生很少发生在散发性MTC或其他甲状腺良、恶性病变的周边。由于早期转移，MTC比其他甲状腺癌，如PTC预后差。大约有一半的患者诊断时有局部淋巴结受累。远处转移是常见的，经常到肾上腺、肺、肝和骨。5年生存率为60%～70%，10年生存率为40%～50%。目前，建立MTC的诊断和预后在很大程度上取决于组织学分析结合免疫组化降钙素染色，在某些病例分析血清降钙素和癌胚抗原水平，它们由MTC分泌。分子诊断在这些肿瘤患者的治疗中具有重要作用。

散发性和遗传性MTC的特点是激活或RET基因突变的“功能获得“，发生RET基因重排少，这与在PTC中所发现的相同。分子诊断检测可能主要用于遗传性MTC，检测结果是建立其诊断的一个重要组成部分，确定检测是否是必需的。约98%的遗传性MTC综合征个体携带生殖细胞RET基因突变，而40%～50%的散发病例携带RET基因突变。有4%～11%的个体表现散发的MTC，实际上携带生殖细胞RET基因突变。因此，筛选散发MTC病例的生殖细胞RET基因突变可以识别可以受益于早期干预的个体，如预防性甲状腺切除术。

既然在MTC中RET基因突变激活，它们通常涉及一个或几个核苷酸的变化，通过丧失正常的激酶抑制机制引起组成性酪氨酸激酶的活化，如同在其他原癌基因如K-RAS和BRAF基因中所见。例如，23%～85%的散发性MTC的16外显子918密码子（ATGACG；MetThr）激活突变，这种突变和15外显子833密码子（GCTTTT；ArgCys）突变占超过98%的MEN2B病例。RET基因突变可用多不同的分子检测方法检测，包括基因芯片、SSCP、测序、温度梯度毛细管电泳、变性梯度凝胶电泳、PCR和HRM。

由于一个或几个RET基因突变常特征化特异的MEN综合征，经常对突变特异性RET基因进行检测。然而，突变特异性检测不能定位未知的或新的突变。为了寻找这样的突变，DNA测序是较好的方法。Ahmed等应用PCR及测序鉴定9个罕见的新型RET基因变异；对6700例疑似MEN2A或家族性MTC（familial medullary thyroid cancer，FMTC）或 MEN2A家族史或FMTC家族史进行了基因分析。从外周血白细胞中提取基因组DNA，应用PCR进行扩增，使用放射性标记的终末循环测序试剂盒（Thermo Sequenase no.US79770；Amersham Life Science，Piscataway，NJ）对由此产生的1785碱基对的扩增子进行变异分析。虽然测序可在扩增的DNA序列确定所有可能的突变/变异，但是，与其他方法相比，它也是相对昂贵的，与其他技术如ASA-PCR相比，其灵敏度较低。

RET基因突变分析本身是一种特异性检测，使其成为较测序技术更灵敏、成本更低的检测技术。例如，Margraf等在疑似MEN的个体用变性的HRN及PCR鉴定RET基因883位密码子918突变。获得正常和918位密码子883杂合突变的DNA样本，纯化DNA，应用包括MEN2B突变密码子的引物进行PCR扩增。将未标记的寡核苷酸探针添加到混合体系，体系中已加入3′氨基适时阻止PCR过程中DNA聚合酶延伸。未标记的寡核苷酸探针携带野生型突变探针序列，其对应于已知的MEN2B RET基因突变。LCGreen染料加入到反应体系。不对称PCR导致ssDNA的积累，方便以后HRN分析。在PCR反应结束时，反应管加热至95℃ 30秒，冷却到50℃产生ssDNA探针双链。HRN数据通过加热反应室到95℃ 30 acquisitions/s收集，分析LCGreen在450nm发射激发光，500nm发射滤波器组合激发光。所有样品测序检测验证。这种技术允许在一个封闭的试管系统快速、准确鉴别MEN2B突变，这是比测序省时省费。

甲状腺肿瘤也常常由FNAs的细胞学检查诊断。在某些情况下，诊断是不可能的，这是由于甲状腺结节细针穿刺活检的样本量不足，固定不佳或缺乏上皮细胞。在这种情况下，为方便诊断，Takano等开发了一种新的分子技术，称其为抽吸活检反向逆转录聚合酶链反应。在这种技术，细针穿刺针获得的细胞用于一个甲状腺癌型特异性基因表达的逆转录PCR。RET原癌基因、calcitonin和癌胚抗原的表达仅限于MTC。Takano等检查35例甲状腺组织标本，包括6例正常甲状腺组织，3例腺瘤样甲状腺结节，6例FA，7例PTC，2例FTC和11例MTC。提取总RNA，应用MLV逆转录酶反转录，1微升所得的cDNA进行PCR扩增，30个循环并进行凝胶电泳分析。引物序列如下：

·RET：5′（5′-GCAGCATTGTTGGGGGACA）（codon 588-594）

·RET：3′（5′-CACCGGAAGAGGAGTAGCTG）（codon 685-692）

·Calcitonin：5′（59-CCTTCCTGGCTCTCAGCATC）（base 57-76）

·Calcitonin：3′（5′-GAGTTTAGTTGGCATTCTGG）（base 445-464）

·Carcinoembryonic antigen：5′（5′-ACAAGGATGCTGTGGCCTTC）（base1，658-1，677）

·Carcinoembryonic antigen：3′（5′-AGGGCTGCTATATCAGAGCA）（base2，211-2，）

·Thyroglobulin：5′（5′-GTTGGCAACCTCATCGT）（base 7，011-7，027）

·Thyroglobulin：3′（5′-AATTCTGCAGTGCCTGGT）（base 7，657-7，674）

·GAPDH：5′（5′-CCATGGAGAAGGCTGGGG）（base 371-388）

·GAPDH：3′（5′-CAAAGTTGTCATGGATGACC）（base 546-565）

在所有样品中检测GAPDH。甲状腺球蛋白（Thyroglobulin）表达于所有正常甲状腺组织、腺瘤性甲状腺肿、FA和PTC而弱表达于4/11的MTC。因此，该技术被认为适于细针穿刺细胞的检测工作。因此，穿刺活检-逆转录PCR可以成为一个有用的分子诊断检测技术，尤其在细胞学采样不足时。