- 膀胱癌卡介苗免疫治疗原理与实践
- 韩瑞发 姚智
- 3207字
- 2020-08-28 07:10:05
第七节 共刺激分子阻断剂
共刺激分子是免疫细胞活化第二信号的提供者,对于免疫应答的发生是至关重要的。根据共刺激分子的结构可分为两类:①TNF-TNFR超家族,包括CD27-CD27L、CD30-CD30L、CD40-CD40L、OX40-OX40L、4-1BB-4-1BBL、RANK-RANKL、TNFR-TNF、HVEM-LIGHT、Fas-FasL等;②免疫球蛋白超家族(immunoglobulin superfamily,IGSF),由三大类分子组成。CD28/B7家族:CD28-B7-1/B7-2、CTLA4-B7-1/B7-2、PD-1/PD-L1/PD-L2、ICOS-GL50、BTLA-HVEM;Tim家族:Tim1-4;黏附分子LFA-1/ICAM-1、CD2-LFA-2等。
一、CD28阻断剂
目前最成功的共刺激分子阻断剂是针对CD28共刺激信号的。Abatacept是CTLA-4细胞外区与修饰的IgG1Fc段的融合蛋白,可以阻断CD80/86与CD28的结合,从而干扰细胞激活所需要的第2信号的传导,导致T细胞对所递呈抗原的耐受。目前该药已完成用于类风湿关节炎Ⅲ期临床试验和治疗牛皮癣性关节炎的Ⅱ期临床试验。尽管Abatacept在自身免疫病的治疗方面作用显著,但是对于移植排斥反应的抑制效果甚微,因此研究者表达了另一种CTLA阻断剂Belatacept(LEA29Y),它是将Abatacept的两个氨基酸残基置换后的产物(L104E和A29Y)。Belatacept与Abatacept相比,与CD80和CD86的结合更为牢固,解离速率降低,药物的体外活性提高了10倍,且能有效抑制移植排斥反应。目前该药已完成治疗器官移植的Ⅲ期临床试验。
二、CD154阻断剂
B细胞的活化也需要双信号刺激,抗原B表位与BCR结合提供第一信号,B细胞作为APC将抗原T表位呈递给T细胞,活化的T细胞表达CD40L(CD154),与B细胞表面的CD40结合,为B细胞的活化提供协同刺激信号。CD154与CD40的结合对于B细胞的活化、增殖、分化及免疫球蛋白的产生、免疫球蛋白亚型转换及记忆性B细胞的发育成熟具有重要意义,同时也为T细胞的活化提供协同刺激信号。研究证实,CD154-CD40在多种炎症过程中发挥作用,无论是动脉粥样硬化还是自身免疫性疾病,阻断CD154-CD40之间的反应可能是治疗上述疾病的重要途径。
Deambrosis I等从噬菌体展示文库中筛选到了9个环肽,它们能够和小鼠骨髓瘤细胞J558L过表达的CD154结合,然而只有环7肽4.10(CLPTRHMAC)能够识别CD154的活化结合位点,其效果与CD154单克隆抗体相当,改变4.10肽的氨基酸组成则该作用消失。4.10肽可抑制CD40介导的B细胞活化,降低B细胞CD80/86的表达水平,抑制IL-4引起的B细胞IgG的类型转换,此外,该CD154阻断肽还可抑制体外上皮细胞的移动及形成毛细血管样结构,抑制人脐带血来源的上皮细胞体内的血管生成能力。
三、BTLA/HVEM/LIGHT阻断剂
疱疹病毒入侵介质(HSV-I entry mediator,HVEM)又称LIGHTR,是TNFR-TNF家族中的一员,它可作为CD28/B7家族成员B、T淋巴细胞衰减因子(B and T lymphocyte attenuator,BTLA)的配体,传到BTLA的抑制信号,负性调节T细胞的活化增殖,亦可作为本家族中LIGHT的受体,传递刺激T细胞活化增值的正性调节信号。因此BTLA/HVEM/LIGHT形成了一个精确调节T细胞活性的网络,同时也为免疫活性药物的开发提供了新靶点。
能够表达BTLA胞外区片段的pcDNA3.1在真核表达体系体内注射,可表达可溶性BTLA胞外片段,竞争性结合HVEM,阻断BTLA的免疫抑制信号,提高机体免疫应答程度,加强Hsp-70肽类肿瘤疫苗的抗肿瘤效果。Han L等构建了表达可溶性BTLA的真核表达载体,与Hsp-70抗原肽、Hsp-70肽类肿瘤疫苗协同作用,增强小鼠的抗肿瘤免疫应答,对宫颈癌具有明显的抑制功能。Gurka S等开发了一系列BTLA特异性抗体,得到了抗体的F(ab)2段,筛选出能够特异性封闭BTLA的抗体,可用于BTLA-HVEM相互作用的体内研究,也可能对机体免疫应答具有调节作用。
LIGHT除了与HVEM结合外,还可与另一受体淋巴毒素(lymphotoxin,LT)β受体LTβR结合,传递免疫激活信号和促进炎症反应。LTβR与免疫球蛋白的可溶性融合蛋白LTβR-Ig可以阻断LIGHT与LTβR的相互作用,抑制炎症反应,改善CIA小鼠的症状。但是HVEM与免疫球蛋白的融合蛋白HVEM-Ig却发挥相反的作用。Pierer M等试图用HVEM-Ig治疗CIA小鼠模型,但结果显示,HVEM-Ig能够促进小鼠T细胞活化,促进IL-6和IFN-γ的分泌,加重小鼠病情。
四、ICOS阻断剂
诱导性协同刺激分子(inducible co-stimulator,ICOS)是CD28家族中的成员,与CD28组成型表达不同,该分子只诱导性表达于活化的T细胞,主要是Th2细胞而非Th1细胞。天然T细胞主要依赖CD28分子提供协同刺激信号,ICOS则在CD28之后发挥作用,促进活化的T细胞分泌细胞因子,如IL-4、IL-5、IL-10、IFN-γ等。ISCO可上调CD154的表达,促进T细胞增殖。ICOS还通过促进IL-10的分泌,对B细胞向记忆性B细胞和浆细胞的分化以及免疫球蛋白的分泌具有促进作用。
近年来发展的ICOS阻断性抗体,如人类全长型的抗体JTA-009、小分子类抗体B7RP-1-Fc和其他ICOSL特异性单抗,可封闭ICOS的作用,抑制小鼠急性抑制物抗宿主反应及抑制排斥反应,抑制CIA小鼠多功能Th1/Th17细胞的聚集,减轻CIA的病理损伤程度。利用ICOS与Ig的融合蛋白ICOS-Ig亦可阻断ICOS的作用,抑制T细胞的功能。
五、PD-1阻断剂
PD-1/PD-L1作为免疫球蛋白超家族协同刺激分子的重要成员,参与自身免疫、移植免疫以及肿瘤免疫等机体免疫调节过程。PD-1是一个主要表达在活化T细胞上的抑制性受体,与其配体PD-L1结合,可显著抑制T细胞的活化和增殖,并调节细胞因子的表达和分泌。PD-1的阻断性抗体可能提高机体免疫应答水平,与肿瘤疫苗合用可提高机体抗肿瘤免疫应答强度。Sakuishi K等研究发现,荷瘤小鼠的CD8+肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)高表达Tim3,而所有Tim3+的TIL均有PD-1+。Tim3+PD-1+的TIL免疫功能低下,对IL-2的反应性低,加之肿瘤细胞高表达Tim3和PD-1的配体(galectin-9和PD-1L),造成Tim3+PD-1+的TIL不能有效发挥抗肿瘤作用。用抗Tim3抗体和抗PD-1L抗体处理,可增强荷瘤小鼠免疫应答,抑制肿瘤生长,延长小鼠生存时间。
六、ICAM-1/LFA-1阻断剂
细胞间黏附分子-1(ICAM-1)属于免疫球蛋白超家族的黏附分子,正常状态下,内皮细胞鲜有表达,但当内皮细胞受到炎性细胞因子(如TNFα和IL-1β)刺激后,可呈现高表达。ICAM-1通过与其配体LFA-1识别,介导白细胞的黏附和浸润。此外,ICAM-1/LFA-1也是一对重要的共刺激分子,参与T细胞活化过程中的免疫突触形成并提供协同刺激信号。鉴于ICAM-1/LFA-1对于免疫系统的重要作用,研究者合成了多种抑制分子来阻断两者之间的相互作用,这些分子主要包括两类:单克隆抗体和肽类抑制剂。
LFA-1是β2组整合素的成员,由CD11a/CD18组成。Efalizumab是一种人源化抗CD11a单克隆抗体,目前已经用于多种自身免疫性疾病的治疗。最近研究发现,可抑制同种异基因淋巴细胞或抗CD3单抗诱导的正常人外周血单个和细胞的增殖,同时对牛皮癣患者外周血单个核细胞也有同样的抑制活性。最近,Efalizumab治疗牛皮癣的临床试验陆续完成,其中包括一项有1255例患者入组的Ⅲ/Ⅳ期临床试验,结果再次证明Efalizumab对于牛皮癣具有显著疗效。Turgeon NA和Posselt AM的临床实验结果表明,Efalizumab能够有效抑制1型糖尿病患者胰岛细胞移植后的免疫应答,显著增加胰岛细胞抑制成功率,帮助患者摆脱对胰岛素的依赖。此外,用Efalizumab治疗的患者未出现白细胞减少、贫血、口腔溃疡和腹泻等不良反应,与传统免疫抑制方案相比,Efalizumab的毒副作用轻微。
cIBC和cIBR是来源于ICAM-1N段D1结构域的环十二肽cIBC和cIBR(图1-16),可有效抑制T细胞的黏附。cIBC和cIBR均具有PRGG基序,该基序处于一个β片层二级结构中,并且具有和ICAM-1 D1结构域中A’和B-β链之间的β转角相似的结构,这是它们能与LFA-1结合的关键。cIBC和cIBR与LFA-1结合的位点不同,前者与LFA-1Ⅰ区域的266~272氨基酸残基结合,该区域点靠近金属离子依赖的黏附位点,而cIBR可与一个叫作L-site的口袋结合,远离cIBC的结合部位。cIBR可抑制cIBC与LFA-1的结合,但反过来cIBC不能抑制cIBR的作用,可见cIBR具有多个LFA-1结合位点。
图1-16 ICAM-1/LFA-1阻断肽
2008年,Iskandarsyah等对cIBR进行了一系列改进,期望得到活性更高、分子量更小的ICAM-1/LFA-1阻断肽。改进主要集中在以下三个方面:①用Cys替代N端的Pen;②采用新的成环方法,如用Lys侧链与Glu侧链环化取代原来的Pen和Cys环化;③去掉C端的某些氨基酸已得到更小环肽。由此得到的一系列环肽(表1-1)。
表1-1 ICAM-1/LFA-1阻断肽
实验结果证实,用C替换cIBR第一位的氨基酸残基Pen得到的cIBR-1,其抑制T细胞黏附的活性与cIBR相似,但用D-Arg替换三位氨基酸残基R(cIBR-1),则活性明显升高。分别用K和E替换1和12位氨基酸,并改变成环方式,得到了cIBR-3。cIBR-3显示出较强的生物学活性,甚至超过其母体cIBR。cIBR-4是在cIBR-1的基础上加入了Leu残基,而cIBR-5、cIBR-6、cIBR-7则是在cIBR-1的基础上去掉了C端的某些氨基酸。cIBR-4抑制T细胞黏附的活性强于cIBR-1,cIBR-7的活性强于cIBR-1、cIBR-6,与cIBR-3、cIBR-4相当。2009年,Bimo AT等正式报道了cIBR-7,在cIBR的结构基础上合成的寡肽cyclo(1,8)-CPRGGSVC。cyclo(1,8)-CPRGGSVC保留了关键基序PRGG,去除了C端的几个氨基酸,与其母体cIBR相比,不但活性稍有提高,而且减小了体积,降低了疏水性,以便于利用疏水性药物为载体进行投递。