第一节　皮肤组织病理学的基本方法

皮肤组织病理学的目的在于了解疾病的发生、发展、转归及治疗方法的选择，主要适用于：①有高度诊断价值的皮肤病，如皮肤肿瘤、病毒性皮肤病和角化性皮肤病；②有诊断价值的皮肤病，如疱疹类皮肤病、代谢性皮肤病、某些肉芽肿性皮肤病和结缔组织病；③无明显特征，但如找到病原体亦可明确诊断的皮肤病，如某些真菌性皮肤病；④无明显特征，但结合临床特征可排除某些皮肤病，如皮肤结核。因此几乎各种皮肤病均可行组织病理检查，但应做到有的放矢，切忌任意采取标本。

一、皮肤活体组织检查的注意事项

（一）皮损的选择

由患者活体取病变组织进行病理检查以确定诊断的方法称为活体组织检查（biopsy），简称活检，优点在于组织新鲜，能基本保持病变的本来面目。皮损的选择应注意：①一般选择成熟，原发皮损，避免早期、晚期或治疗后皮损；②水疱、脓疱应取早期皮损，取材时防治水疱破裂；③血管炎应取12～24小时以内皮损，时间长的皮损血管壁纤维蛋白渗出会消失，时间短的核尘不明显；④多部位、多点取材，如蕈样肉芽肿、脓疱性皮肤病等；⑤取材应包括正常皮肤，尤其是皮肤肿瘤和色素性皮肤病。

（二）皮肤组织的取材方法

采取皮肤标本的方法主要有：手术切取法、环钻法、削取法等。其中手术切取最常用，适应于各种要求及大小不同的标本。切取时应注意：①切缘锐利整齐；②切口方向尽量与皮纹一致，两端对齐；③应夹持组织两端，切忌夹持组织中间，以免夹坏组织影响观察；④切取标本应足够深、足够大。此方法特别适用于肿块等皮下病变的取材，对所有脂膜炎、血管炎及脱发的鉴别宜采用手术切取法。同时提倡采用该方法对皮肤肿瘤进行检查。环钻法简便易行，但只适用于小的损害，或病变限于浅表处，或手术切取有困难者，缺点为所取组织较小，不易取得血管及皮下脂肪，并会使组织歪斜，造成诊断困难。削取法主要适用于良性、向外生长的皮肤肿物或错构瘤，如疣、皮赘、脂溢性角化病等。削取法不能用于恶性肿瘤及向内生长的皮肤肿物，也不适于炎症性皮肤病。

（三）标本处理

切取后组织标本应立即放入固定液中。组织固定是后续检查的关键，根据不同需要采用不同方法进行固定。常用的固定液为10%甲醛溶液，肥大细胞增生症、痛风等疾病标本需用95%酒精固定。如需要进行免疫病理检查，应将组织置于4℃冷生理盐水纱布中尽快送包埋处理。对于电镜标本，则应立即将标本以剃须刀片分割开，在滴有4℃电镜固定液的蜡块或玻璃板上，用剃须刀片分割成约1mm × 1mm × 1mm大小，放入4℃电镜固定液中送检。如需留取细菌或真菌培养标本，注意严格无菌操作，应优先留取培养标本后再处理其他标本。

二、皮肤组织病理学检查的常用方法

皮肤组织标本获取后，可根据不同的疾病和检查目的运用不同的检查方法。

（一）苏木精-伊红染色（简称HE染色）

最常用，也是最基本的方法，具有操作方便、结果稳定的特点，大多数皮肤病用HE染色可获得正确的诊断。皮肤组织病理切片制作过程同其他病理组织，标本经固定、脱钙、脱水、透明、石蜡包埋、切片、脱蜡后染色。切片经苏木精染色后，先经1%盐酸乙醇处理2～3秒，流水冲洗20～30分钟后再行伊红染色，可使组织染色对比鲜明。

（二）特殊染色

少数病例HE染色下所见某些可疑物或病变不能明确时，或需与其他疾病鉴别时，可做特殊染色。常用的特殊染色方法、目的和结果见表4-1。

（三）免疫组织化学技术

应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂（荧光素、酶、金属离子、同位素）显色来确定组织细胞内抗原（多肽和蛋白质），对其进行定位、定性的研究，称为免疫组织化学技术（immunohistochemistry）或免疫细胞化学技术（immunocytochemistry）。

免疫组化在皮肤病理诊断中的作用主要是：①肿瘤诊断：50%～70%恶性肿瘤性质的判断依赖于免疫组化。特别适用一些低分化肿瘤确定组织起源；②协助疾病判断愈后：如PCNA和Ki67有助于细胞增殖活性的判断；表达细胞毒颗粒的淋巴瘤通常愈后较差；③提示疾病的病因：在间变大细胞淋巴瘤中ALK-1（+）常提示具有染色体t（2；5）异位，LMP-1（+）提示与EBV感染有关。与皮肤免疫组化有关的常用抗体包括上皮来源标志（包括广谱角蛋白AE1/AE3和不同分子量的CK）；间质来源标志（波形纤维蛋白，Vimentin）；血管来源标志（CD31，CD34）；肌肉分化标志（SMA，Desmin）；黑素细胞分化标志（S100，HMB45，MELAN-A）；组织细胞分化标志（CD68，S100，CD1a）；淋巴细胞分化标志（CD3，CD4，CD8，CD20，CD30，CD45，CD56）；神经内分泌类标志（NSE，Syn）；中枢神经类（NF，GFAP）；增殖相关标志Ki67。

由于相当多肿瘤缺乏特异性抗原，而且同一种抗原可在多种肿瘤中表达，如Vimentin对软组织肿瘤并不具有特异性，很多癌和淋巴瘤也可以表达，还有一部分肿瘤由于分化很差造成部分抗原的丢失，因此必须强调应以光镜下的形态表现为主，辅以正确的免疫组化结果才能得出正确的诊断。

问题与思考

1.皮肤组织病理的适应证有哪些？

2.皮肤组织石蜡切片常用的特殊染色方法及意义。

（四）免疫荧光检查

免疫荧光是一种特殊的免疫组织化学技术，根据抗原抗体特异性结合的反应特点，将荧光色素与某些特异性抗体（抗原）以化学的方法结合起来（不影响血清抗体或抗原的免疫特性），而后将荧光标记抗体（抗原）在特定的条件下浸染标本，使与标本中的抗原（抗体）发生结合反应，反应后在荧光显微镜下观察到含有荧光标记的抗原抗体复合物的存在，根据已知抗原（或抗体）推知另一个未知的抗体（或抗原），以协助诊断。

适用于大疱性皮肤病、结缔组织病等自身免疫性皮肤病、某些病原体检测及肿瘤的鉴别诊断，主要有直接免疫荧光法、间接免疫荧光法、免疫酶标法和补体结合法。

1.直接免疫荧光法（direct immunofluorescence，DIF）

主要用于检测病变组织中存在的抗体或补体。将冷冻切片组织固定于玻片上，滴加荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体或抗C3抗体等，经孵育、清洗等处理后，置于荧光显微镜下观察。若组织中有人免疫球蛋白或C3沉积，则荧光素标记抗体与之结合呈现荧光。皮肤直接免疫荧光检查的基本改变为：

（1）基底膜荧光：

①系统性红斑狼疮、盘状红斑狼疮、亚急性皮肤型红斑狼疮：基底膜带呈线状、颗粒状或团块状荧光，以IgG及C3为主；②疱疹样皮炎：真皮乳头内基底膜带颗粒状IgA沉积；③类天疱疮、获得性大疱性表皮松解症：线状IgG及C3沉积；④线状IgA大疱性皮肤病：基底膜带线状IgA沉积。

（2）表皮细胞间荧光：

寻常型、红斑型、落叶型、增殖型天疱疮及疱疹样天疱疮等，可见表皮细胞间IgG沉积。

（3）血管壁荧光：

多种血管性皮肤病，如白细胞碎裂性血管炎、结节性多动脉炎等显示管壁及管周荧光。

2.间接免疫荧光法（indirect immunofluorescence，IIF）

主要用于检测血清和体液中存在的自身抗体，并可做抗体滴度分析。如结缔组织病、大疱性皮肤病和其他自身免疫病的诊断。底物取自正常人皮肤或动物组织（如鼠肝切片），将患者血清或体液滴于底物上，若其中存在抗体，则与底物中的相应抗原结合，再滴加荧光标记的抗人免疫球蛋白抗体等，置荧光显微镜下观察。荧光标记抗体与结合到底物上的抗体结合，呈现荧光。