第三章　肝脏免疫学

肝脏是人体最大的实体器官，重约1.5kg，约占人体重的2%，其最主要的生理功能是蛋白质合成和氨基酸、糖类、脂类和维生素等代谢。肝脏位于右上腹部，其门静脉收集了大量来自消化系统的血液，因此持续暴露于过量的各类抗原。与胸腺、淋巴结和脾脏等经典的免疫器官相比，肝脏是人体最重要的免疫器官之一，并执行重要的免疫监测和免疫耐受功能。

一、肝脏免疫耐受的特征

大量证据已经显示，肝脏是一个免疫耐受器官，具体表现如下：①在MHC分子错配的动物模型中，肝移植是可行的；②门脉内注射抗原，肝脏表现为耐受，并进一步诱导全身系统耐受；③口服耐受依赖于肝脏的存在；④肝炎病毒感染，通常诱导肝脏免疫耐受。肝脏免疫耐受的机制还不清楚，可能与肝脏的细胞组成和功能有关。

二、肝脏的细胞组成

肝脏由多种细胞组成，主要分为肝实质细胞和非实质细胞，肝细胞是最主要的肝脏实质细胞群，约占肝脏总量的80%；而肝脏非实质细胞约占肝脏总量的5%～6%，主要包括肝脏窦内皮细胞，库普弗细胞、肝星状细胞以及肝内淋巴细胞；剩余的14%～17%肝脏主要由细胞外空间组成。其中，肝脏非实质细胞虽然较少，但却组成丰富，其构成主要为45%的肝脏窦内皮细胞，33%的库普弗细胞，22%的肝星状细胞以及少许肝内淋巴细胞（图3-1）。这些细胞和成分，共同构成了肝脏5大系统：血管系统，胆管系统，肝小叶，窦间隙和肝脏内基质系统；每一种系统均直接或间接影响肝脏的天然和特异性免疫系统。

三、肝脏的淋巴细胞构成

一个健康成年人体肝脏大约0.75×1010～1.5×1010个淋巴细胞（每100mg肝组织约有50万～100万个淋巴细胞）。肝脏固有淋巴细胞主要包括T细胞，B细胞，NK细胞、NKT细胞以及少量树突状细胞等；其中，CD3+CD56-的T细胞约占23%，CD3-CD56+的NK细胞约占20%～30%，而CD3+CD56+的NKT细胞约占50%，B细胞约占5%（见图3-1）。许多肝脏固有的淋巴细胞亚群表型和功能与外周血差异较大，但其机制至今尚未完全阐明。

1.T细胞

肝内T细胞主要包括αβT细胞和γδT细胞，其中前者约占肝内T细胞的80%，而后者约占20%；γδT细胞，它在肝内的比重是外周血的5～8倍，其在肝内的免疫调节功能尚不明确。有研究报道，肝内的γδT细胞可保护ConA诱导的急性肝衰竭，可能通过分泌IL-17A发挥作用，或者通过调节NKT和Th17细胞发挥保肝作用。此外，γδT细胞还被证明具有重要的抗感染、抗肿瘤以及诱导和维持肝脏自身免疫疾病等作用，其具体机制尚不明确。

2.NK和NKT细胞

自然杀伤细胞（Natural killer cell，NK细胞）是天然免疫系统中最主要的细胞组分之一，在宿主抗病毒和抗肿瘤方面发挥关键作用。NK细胞在肝组织中，约占淋巴细胞的30%，在外周血约为10%。NK细胞的活化状态受到细胞表面表达的一系列抑制性和活化性受体的调节。NK细胞表面表达的受体包括三类：①杀伤细胞免疫球样受体（KIR），主要识别 HLA-Ⅰ类分子如 CD158a，CD158b，CD158e；②C 型凝集素受体，包括活化性受体NKG2C，NKG2D，NKG2E和抑制性受体NKG2A；③自然细胞毒受体包括NKp30，NKp44和NKp46，其中NKp46被认为是主要的活化性受体。不仅如此，NK细胞反应强度和质量也受到细胞因子的调控，包括Ⅰ型干扰素、白细胞介素（interleukin，IL）-12、IL-15和IL-18。通常，根据CD56表达强弱和是否表达CD16可将NK细胞分为两个亚群：CD56brightCD16neg亚群和CD56dimCD16pos亚群。近期研究已经将NK细胞分类到天然淋巴细胞亚群（innate lymphoid cell-1，ILC-1）。此外，记忆性NK细胞（memory NK cells）也已经在小鼠体内被鉴定。肝脏NK细胞已被证实参与肝脏抗病毒、肝损伤以及肝纤维化过程。将来的研究应该重点研究这些NK亚群在肝内的分布和功能及其与人类疾病的关系。

NKT细胞也是一群异质性细胞，主要表达NK细胞和T细胞标志物，识别非经典的MHC I类分子CD1提呈的脂质抗原。NKT细胞主要通过分泌IFN-γ和IL-4在肝脏损伤、炎症、纤维化和肝再生过程中发挥重要的调节功能。

3.肝脏抗原提呈细胞

肝脏含有多种具有独特功能的抗原提呈细胞，肝内的抗原提呈细胞与肝脏的免疫耐受有关。库普弗细胞和肝脏DC是经典的肝脏抗原提呈细胞；此外，肝细胞、肝脏窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）也与肝脏的免疫耐受有关。

（1）库普弗细胞：

肝脏库普弗细胞（kupffer cells）是最早证明与肝脏免疫耐受有关的细胞亚群。早期研究发现，LPS刺激能库普弗细胞产生IL-10，并进一步降低LSEC表面的MHCⅠ和Ⅱ类分子的表达。另外，来源于库普弗细胞的前列腺素E2也能够减少LSEC活化抗原特异性CD4 T细胞的能力；库普弗细胞还能与Treg相互作用，促进Treg产生IL-10，有助于诱导系统性免疫耐受。当然库普弗细胞还能分泌IL-18等细胞因子以促进NK细胞活化，从而消除病原体。

（2）肝脏DC细胞：

肝脏DC细胞多聚集在中央静脉小叶区，少部分分布在肝实质内。根据其表型特征，肝内 DC 主要分为 5 个亚群：淋巴样（CD8α+，B220-，CD11b-），浆样（CD8α-，B220+），髓样（CD8α-，B220-，CD11b+），浆样和髓样混合（B220-，CD11b-）以及 NK DC（B220-，CD11cint，CD69+，2B4+，DX5+）。相对于脾脏DC，肝脏DC由于其特殊的构成比例以及共刺激分子的表达水平低而显示出较弱的免疫刺激性。

（3）肝窦内皮细胞：

肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cell，LSEC）是肝内有效的抗原提呈细胞之一，它表达高水平的MHC分子、不同的刺激分子和CD11c，并能够摄取抗原、活化纯真T细胞。LSEC还能诱导抗原特异性CD8 T细胞对口服抗原的耐受，其中Fas/FasL途径对于LSEC介导的免疫耐受起关键作用。此外，LSEC还能上调B7-H1/PD-1信号介导CD8 T细胞耐受。

（4）肝星状细胞：

肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC），是肝内另外一群抗原提呈细胞。在正常生理条件下，HSC控制着血流通过窦间隙；而在病理条件下，不同的炎症刺激可刺激它成为成纤维细胞，进而形成瘢痕。与LSEC比较，HSC的抗原提呈能力有限。在胰岛移植小鼠模型中，HSC移植显著降低了胰岛的排斥反应，显示出HSC具有免疫抑制功能。HSC的耐受能力主要体现在它们有能力产生维甲酸（维A酸）和TGF-β；此外，活化的HSC还高表达PD-L1，通过诱导凋亡来抑制T细胞反应。

（5）肝细胞：

大量的研究证实肝细胞也可充当抗原提呈细胞。肝细胞能够致敏纯真CD8 T细胞，诱导其扩增，但在缺乏共刺激信号的时候，扩增的CD8 T细胞发生凋亡，从而克隆删除诱导肝脏免疫耐受。

上述研究提示，肝脏内免疫细胞的组成和功能是决定肝脏免疫耐受倾向的重要原因。当抗原被肝内的抗原提呈细胞呈递给T细胞时，机体的免疫应答趋向免疫耐受。因此，利用已知抗原可通过诱导肝脏免疫耐受从而治疗自身免疫性疾病。此外，HBV和HCV感染通常也利用肝脏免疫耐受建立慢性感染，打破肝脏的免疫耐受有可能清除肝炎病毒。因此，哪些细胞亚群或分子是肝脏免疫耐受建立的关键成分？靶向这些细胞或分子能否打破肝脏免疫耐受和重建免疫耐受？阐明这些问题为将来治疗肝脏疾病提供重要的依据。

四、肝脏免疫紊乱和疾病

肝脏是人体最大的腺体，也是最主要的消化器官，同时接受来自肝动脉和门静脉的血供。如前所述，肝脏具有完备的天然免疫和适应性免疫系统。如何保持对非致病分子（如食物及肠道正常菌群）的免疫耐受性状态，同时识别、激活机体特异性免疫来应对外来病原微生物的入侵，成为肝脏免疫的最重要功能。而当这种免疫平衡被打乱时，将导致各种肝脏疾病的发生，如自身免疫性肝病、病毒性肝炎、肝癌等。

1.自身免疫性肝病（autoimmune liver diseases，ALD）

自身免疫性肝病是一类以肝脏功异常和肝脏病理损害为主要临床表现的非传染性肝病。包括自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis，PBC）、原发性硬化性胆管炎（primary sclerosing cholangitis，PSC）和重叠综合征（overlap syndromes）。我们将重点围绕原发性胆汁性肝硬化的肝内免疫紊乱展开讨论：

原发性胆汁性肝硬化是一种自身免疫介导的慢性炎症性、胆汁淤积性肝脏疾病。以进行性肝内的中、小胆管的非化脓性炎症，胆汁淤积和肝纤维化为特点，最终进展至肝硬化和肝功能衰竭。流行病学研究显示，该病的发生与遗传易感性和环境因素密切相关，但最主要的还是与肝脏免疫功能的紊乱（即免疫耐受的打破）密切相关。

天然免疫系统的超敏化（hypersensitivity）：在正常肝脏中，天然免疫细胞：树突状细胞（DC）、库普弗细胞（Kupffer cells）、肝窦内皮细胞（liver sinusoidal endothelial cells）和肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）等，通过分泌抗炎症因子IL-10和TGF-β，和表达负性调控因子PD-L1等，维持肝脏的免疫耐受状态；而在PBC的患者中，天然免疫系统处于超敏化的状态：①用TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR9刺激PBC患者的PBMC后，与正常人相比，其分泌更多的炎症因子；②损伤的胆小管周围有活化的DC细胞，他们通过对抗原的呈递作用，激活PDC-E2特异性CTL，促进免疫耐受的打破，导致进一步的病理损伤；③PBC 患者的单核细胞受LPS刺激后，表面的TLR-4的表达明显升高，并且分泌更多的炎症相关因子：如IL-1β、IL-6、IL-8和TNF-α等，促进疾病的进程；④肝脏中的NK细胞具有维持免疫耐受的功能，但在PBC患者中，外周血和肝脏内的NK细胞数量明显升高，并且具有更强的杀伤功能，可能促进PBC患者胆小管的损伤；⑤NKT细胞在肝脏中具有调节天然免疫和适应性免疫的功能。动物模型显示，NKT细胞数量和功能的增加可促进PBC患者疾病的进展，最终导致胆小管的损伤和肝脏的纤维化形成。

适应性免疫细胞的活化与扩增：在PBC患者中，辅助性CD4T细胞的功能明显增加（如：Th1/Th2比例明显升高；Th17细胞在肝脏胆管周围明显增加），而抑制性免疫细胞Treg的数量明显降低。同时，PDC-E2特异性免疫细胞的数量在PBC患者的损伤胆管周围明显增加：①PDC-E2特异性自身反应性CD4 T细胞的数量在肝脏淋巴结内的数量是外周血的100-150倍；②PDC-E2特异性自身反应性CD8 T细胞的数量在肝脏内的数量是外周血的10倍左右；③CD4与CD8特异性的抗原识别位点与B细胞的识别位点具有一部分的重叠区域，主要围绕硫辛酸结构域内部的（inner lipoyl domain）硫辛酰化的氨基酸K173位点。

2.病毒性肝炎（viral hepatitis）

病毒性肝炎是由多种不同的嗜肝病毒引起的一组以肝脏损伤为主的传染性疾病。目前已确定的有甲型、乙型、丙型、丁型和戊型肝炎五种类型，其中我国主要以乙型病毒性肝炎（HBV）为主。

乙型肝炎病毒感染后，根据机体的免疫功能状态，可以分为急性病毒性肝炎和慢性病毒性肝炎。对成人而言，急性病毒感染后，机体的免疫系统能够应对HBV病毒的侵入，并最终有约95%的病人能够清除体内的病毒，获得自愈。而对儿童，由于免疫系统的发育不全等原因，最终导致疾病的慢性化，进入免疫耐受期，免疫清除期和低复制期。其中，肝脏免疫在各个时期也发挥着重要的作用。在免疫耐受期，肝内的IL-10、TGF-β、PD-L1和Treg细胞高表达，而TLR则低表达，导致了机体免疫耐受状态的维持，即HBV病毒的持续复制，但肝脏功能没有损伤（即ALT水平正常）。由于某种因素的作用，肝脏的免疫耐受状态被打破，肝内的细胞因子的分泌发生了变化，IL-12、IL-18和IFN-α的分泌明显升高，而IL-10的分泌下降。此时，肝脏免疫被部分激活，HBV病毒的复制被部分抑制，肝脏出现一定的损伤。在免疫清除期，上述肝内细胞因子的分泌进一步增强，同时伴DC、NK、Th17、巨噬细胞和T淋巴细胞大量的浸润入肝，导致肝脏的进一步损伤，甚至导致肝脏功能的衰竭，但病毒并没有被全部清除，最终导致疾病进入低复制期（慢性化）。

3.肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）

肝癌是全球癌症相关性死亡的主要原因之一，每年大约有100万以上的人发病和并有超过50万的人死于此病，约占全球恶性肿瘤死亡原因第3位，它也是我国最常见且恶性肿瘤之一。

肝癌的形成与肿瘤微环境密切相关。一般包括细胞成分（肝实质细胞、成纤维细胞、免疫细胞、内皮细胞、间充质干细胞等）和非细胞成分（生长因子、细胞因子、细胞外基质、激素和病毒等）。其中，肝脏的免疫学功能在肝癌的发生、发展过程中扮演的重要的角色。一方面，肝内的免疫细胞如NK、NKT、B细胞、CD8 T和CD4T细胞通过直接的或者间接的作用，清除肿瘤细胞，抑制肿瘤的产生；另一方面，一些免疫抑制效应细胞，如Treg，MDSC等则通过抑制上述效应细胞的功能，促进肿瘤的产生和进一步的恶化。最终，肝内免疫功能的状态（紊乱或正常）决定了肿瘤细胞的命运。

尽管针对上述肝病的药物和治疗方法层出不穷，但并不是所有的病人都得到了彻底的治愈。未来，肝内免疫功能紊乱的调节，将成为后续难治性肝病的重要靶点。

五、肝病免疫治疗技术

1.免疫细胞治疗

越来越多的证据表明，免疫反应在控制肝脏肿瘤和病毒感染中发挥着重要作用。近30年来以免疫细胞为基础的治疗方法也取得了重要进展。

成熟的DC能够刺激T细胞活化，诱导抗肿瘤免疫反应，从而较早的被应用于HCC的免疫细胞治疗。目前的研究结果提示DC细胞治疗能够诱导AFP特异性免疫应答、增强NK细胞活性、使CD4+CD25highTreg下降和CD8+CD28-效应细胞增加，临床上可以观察到AFP水平的下降和生存率改善。目前以DC为基础的免疫细胞治疗均取得了较好的临床安全性，但治疗效果主要局限于患者免疫状态的改善，肿瘤缩小、复发率的降低和生存时间的延长等临床疗效方面还缺少令人信服的大样本研究结果。限制DC细胞疗效的原因可能有以下几点：首先DC的成熟状态决定了它在免疫调节中的作用方向，成熟DC诱导抗肿瘤免疫，未成熟DC的抗原提呈作用则主要诱导免疫耐受；肿瘤局部注射DC细胞可能会出现DC被局限在肿瘤内部而不能向二级淋巴器官迁移；另外，利用肿瘤裂解液可能并不能有效提供肿瘤特异性的抗原，且这些抗原在健康组织也有一定程度的表达，从而可能诱导DC的免疫耐受；肿瘤组织也在通过募集或诱导Treg生成，大量表达IL-10和TGF-β等方式抑制免疫应答，或修饰隐藏自身抗原达到逃避免疫应答的作用。

过继性细胞免疫治疗也是研究较多的一种抗肿瘤治疗方法，主要包括淋巴因子活化的杀伤细胞（lymphokine-activated killer cells，LAK）、细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokine-induced killer cells，CIK）和细胞毒T细胞（cytotoxic T cells，CTL）。LAK和CIK细胞具有较强的肿瘤溶解活性和非MHC限制性，对自体和异体肿瘤均有较强的杀伤作用，并显著降低肝癌切除后的复发率降低。肿瘤特异性的CTL细胞在外周血存在极少，基本需要从自体肿瘤中提取，并存在扩增困难和MHC限制性等问题，使其在肝癌治疗中的应用受到限制。NK细胞由于具有较强的细胞溶解和细胞因子分泌作用，同时诱导抗原提呈细胞活化，最近的一项研究发现，应用NK细胞、γδT细胞和CIK细胞联合射频消融可以显著延长肝癌患者的无进展生存期且无明显副作用，并且增加细胞治疗次数效果更佳。

综合现有的数据，去除肿瘤的免疫抑制可能进一步增强细胞免疫治疗的效果，但仍需要大样本的随机对照试验进一步证实。而在合适的治疗时机与其他抗肿瘤手段联合应用则可能是更好的选择。

慢性乙型肝炎（CHB）是免疫细胞治疗的又一重要领域，主要的治疗目标是控制病毒复制。我们的研究发现，自体CIK细胞能够降低CHB患者的病毒载量，并促进HBeAg转阴和血清学转换，这一效果与患者DC细胞的数量和功能恢复有关。应用HBsAg和HBcAg负载的DC细胞可以有效增强HBV特异性的CTL反应，在联合CIK治疗后，可明显降低HBVDNA。CpG等佐剂的应用、阻断抑制性通路和优化抗原负载则可能进一步增强DC疫苗效果。

2.间充质干细胞治疗

间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）是一群来源于发育早期中胚层和外胚层的多能干细胞，主要来源于骨髓、脐带、脐带血、脂肪等组织。在细胞治疗、组织工程以及再生医学领域内，间充质干细胞可用于修复、替代受伤或病变的多种组织器官。除可塑性外，MSC在免疫调节、维持造血微环境稳定性等方面也具有重要作用。作为一种新型免疫治疗方案，MSC在肝硬化、肝衰竭和遗传代谢性肝病等方面显示出良好的治疗效果。主要效应机制包括拮抗炎症反应、调节机体免疫功能、促进肝细胞再生等。

MSC有自体和异体之分，但因其免疫原性低均不存在诱发异种排斥反应的风险。利用自体MSC治疗肝硬化的临床研究证实，MSC治疗6个月后，患者的MELD评分降低，肝功能和白蛋白合成功能得到改善。利用异体MSC治疗失代偿性肝硬化的临床研究显示细胞治疗后肝脏胆红素水平、腹水生成量明显减少，肝脏白蛋白合成能力提高。应用异体MSC治疗终末期肝病的临床结果证实，MSC治疗4周后，患者的症状得到显著改善。

MSC的效应机制目前还不完全清楚。动物实验显示进入体内的MSC能有效抑制肝脏炎症、减少纤维化形成，同时具有分化为肝细胞的潜能。但更多的研究观点认为，MSC对肝脏功能的修复作用主要来自分泌效应而非直接向靶细胞的分化。自身分泌的高水平肝细胞生长因子、白细胞介素 6（IL-6）、IL-7、G-CSF、TGF-β等是主要效应因子。

（王福生）

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