第4章　蛋白质的共价结构

4.1　复习笔记

一、蛋白质通论

1蛋白质的化学组成和分类

（1）蛋白质的组成

表4-1　蛋白质中各元素的组成百分比

①蛋白质是一类重要的生物大分子，主要含有碳、氢、氧、氮和少量的硫，有些蛋白质还含有一些其他元素（表4-1）。

②凯氏定氮法是根据蛋白质的平均含氮量为16%，测定样品中的含氮量即可推算出样品中的蛋白质含量。

蛋白质含量＝蛋白氮×6.25

其中6.25即16%的倒数，为1g氮所代表的蛋白质量（克数）。

（2）蛋白质的分类

①按组成将蛋白质分为单纯蛋白质和缀合蛋白质。

②按形状和溶解度可分为球状蛋白质、纤维状蛋白质和膜蛋白。

③按功能可分为酶、运输蛋白、营养和贮存蛋白、激素、受体蛋白、运动蛋白、结构蛋白、防御蛋白等。

2蛋白质分子的形状和特点（表4-2）

表4-2　蛋白质的形状及特点

3蛋白质功能的多样性（表4-3）

表4-3　蛋白质的主要功能及实例

二、肽

1肽和肽键的结构

（1）肽

肽又称肽链，是由两个或两个以上的氨基酸通过肽键共价键连接形成的线性聚合物。根据肽中所含的氨基酸个数可将肽分为二肽、三肽、四肽、五肽等，最简单的肽是二肽。

（2）肽键

肽键是指一个氨基酸的α-羧基和另一个氨基酸的α-氨基脱水缩合形成的酰胺键（—CO—NH—）。由于酰胺氮上的孤电子离域与羰基碳轨道重叠，因此在酰胺氮与羰基氧之间发生共振相互作用。肽键共振产生以下几方面的重要结果：

①限制绕肽键的自由旋转；

②组成肽基的4个原子和2个相邻的C_α倾向共平面，形成肽平面；

③C-N键具有部分双链性质，C＝O键具有部分单链性质；

④肽键具有永久偶极；

⑤肽键具有反式构型。

（3）二硫键

二硫键又称二硫桥，是指在蛋白质和多肽分子之间由两个半胱氨酸残基的侧链之间形成的键，它可以使两条单独的肽链共价交联起来或使一条链的某一部分形成环，在蛋白质的三维结构中起重要作用。

2肽的物理和化学性质

（1）肽的物理性质

①短肽是离子晶格，在水溶液中以偶极离子；

②肽具有旋光性，一般短肽的旋光度约等于组成该肽中各个氨基酸的旋光度的总和；

③肽的酸碱性质主要决定于肽键中的游离末端α-NH₂、α-COOH和侧链R基上的可解离基团。

（2）肽的化学性质

①茚三酮反应

肽的N端氨基酸残基和茚三酮也能发生定量反应，生成蓝紫色，反应并不放出CO₂。这一反应广泛地应用于肽的定性和定量测定。

②双缩脲反应

双缩脲反应是指肽与碱性CuSO₄反应，生成紫红色或蓝紫色复合物的反应，是肽和蛋白质所特有一个颜色反应。反应颜色的深浅与肽或蛋白质的含量成正比，利用这个反应借助分光光度计可以测定蛋白质的含量。

3还原型谷胱甘肽

（1）定义

动植物细胞中都含有一种重要的三肽即还原型谷胱甘肽，全称γ-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸，它含有游离的SH基，常用GSH来表示。根据其性质可分为氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽。

（2）作用

①还原型谷胱甘肽在红细胞中作为巯基缓冲剂存在，维持血红蛋白和红细胞其他蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态；

②谷胱甘肽可参与细胞内的氧化还原反应保护细胞，是一些酶的辅酶组成成分。

三、蛋白质一级结构的测定

1蛋白质测序的策略

（1）概述

蛋白质的一级结构是指氨基酸残基的组成、数目以及排列顺序。测定蛋白质的一级结构，要求样品必须是均一的，纯度应在97%以上，同时必须知道它的相对分子质量。

（2）氨基酸测序步骤

表4-4　氨基酸测序的步骤及过程

2N-末端和C-末端氨基酸残基的鉴定

表4-5　蛋白质中氨基酸鉴定常用的方法

图4-1　肽链分析中酶解法常用的酶及其专一性

3肽段氨基酸序列的测定

（1）Edman化学降解法

Edman化学降解法又称苯异硫氰酸酯（PITC）法，用于N-末端基分析。反应时Edman降解试剂（PITC）与多肽链的游离氨基作用，分三步进行。

①偶联反应：由于PITC只能与未质子化的-NH₂起作用，所以反应在弱碱性介质中进行。

②环化断裂反应：在无水强酸介质中，第一步反应形成的PTC-肽最靠近PTC基的肽键将发生断裂，同时PTC-氨基酸残基环化成噻唑啉酮苯胺衍生物。反应必须在无水条件下进行，否则其他肽键也将被水解。

③转化反应：将第二步中生成物在酸性水溶液中将它转变为PTH-氨基酸。

（2）酶降解法

利用肽链外切酶（外肽酶），如氨肽酶和羧肽酶分别从肽链的N-末端和C-末端逐个地向里切，以此来确定肽的氨基酸序列。

（3）质谱法（MS）

因为MS测序要求样品是挥发性的，蛋白质（以及核酸和糖类）这类生物大分子的挥发性很低，且加热易被分解，故衍生出电喷射电离串联质谱法或气谱-质谱联用法。MS灵敏度高、所需样品少、测定速度快。

（4）根据核苷酸序列推定法

根据中心法则来进行核苷酸的序列推定。

4肽段在多肽链中次序的决定

利用两套或多套肽段的氨基酸顺序彼此间的交错重叠，拼凑出整条多肽链的氨基酸顺序，即重叠肽拼凑法。

5二硫键位置的确定

（1）胃蛋白酶处理蛋白质，得到含有二硫键或者二硫桥的较小肽段；

（2）经对角线电泳分离各肽段：

①用过甲酸断开二硫键，含有-S-S-的肽段带电性质发生变化，转向90℃二次电泳，二硫键的肽段迁移率发生变化；

②同其他方法分析的肽段进行比较，确定二硫键的位置。

四、蛋白质的氨基酸序列与生物功能

1同源蛋白质物种差异与生物进化

（1）同源蛋白质

同源蛋白质是指在不同物种中行使相同或相似功能的蛋白质。同源蛋白质一般具有几乎相同长度的多肽链，并且它们的氨基酸序列与提取它们物种的亲缘关系具有同一性。

①不变残基：对蛋白质生物功能所必需的氨基酸残基在进化过程几乎保持不变，称为不变残基。

②可变残基：是指对蛋白质功能不太重要的氨基酸残基在进化过程中可能发生改变，称为可变残基。

（2）细胞色素c

细胞色素c存在于所有真核生物的线粒体中，是一种含血红素的电子转运蛋白，含有100多个氨基酸残基，其中28个是不变残基。细胞色素c的氨基酸序列资料可用来核对各个物种之间的分类学关系以及绘制系统进化树，细胞色素c序列的研究为同源性提供了最好的证据。

2同源蛋白质具有共同的进化起源

（1）同源蛋白质的氨基酸序列分析揭示了这些蛋白质具有共同的进化祖先，但进化的时间和进程抹去了它们有共同祖先的大部分证据；

（2）在进化途径中，具有同源关系的的蛋白质基因的随机突变导致一级结构方面氨基酸取代和分歧或趋异事件的进化顺序；

（3）基因的突变和复制是创造多样性的重要进化力，因此很多同源性蛋白质显示不同的功能；

（4）代表物质有氧合血红素蛋白质、丝氨酸蛋白酶类以及一些功能差异很大的蛋白质。

五、肽和蛋白质的人工合成

1肽的人工合成

（1）肽的人工合成类型

2胰岛素的人工合成

我国科学家首次合成牛胰岛素的主要途径是先分别合成A链二十一肽和B链三十肽，再将A、B两条肽链经还原、氧化连接成牛胰岛素。

（1）A链合成是先分别获得N端九肽和C端十二肽，然后脱去十二肽N端的保护基，与九肽以叠氮法缩合成带保护基的A链。

（2）B链的合成采取8＋22的途径，为了避免大肽连接时发生消凝，特意在B₈、B₂₀、B₂₃的甘氨酸残基处分段，合成了以甘氨酸为羧端的肽段。在不得不用其他氨基酸为C末端时，尽量用叠氮法或者活化酯法接肽以保证光学纯度。

（3）在A、B链的基础上进行全合成。带保护基的二十一肽和三十肽衍生物分别用Na-液NH3处理后，再用连四硫酸钠和亚硫酸钠进行S-磺酸化，经初步纯化后得到二十一肽和三卜肽的SSO₃-衍生物。A链和8链按l.2：1.0的分子比混合，以摩尔的巯基乙酸还原，然后在空气中氧化，再经提纯提纯后得到产物。

3固相肽合成

（1）在固相合成中，肽链的逐步延跃是在不溶性聚苯乙烯树脂小珠上进行的，这是为了反应后可通过简单的过滤回收被延长的产物，用于下一步合成；

（2）固相肽合成的简略步骤为挂接、去保护、中和、缩合、断裂与去保护，合成方向为C端→N端。