第三节　液相色谱技术的应用

一、液相色谱技术在医药领域的应用

（一）中药材甘草中甘草苷及甘草酸含量的测定[参考《中华人民共和国药典》（2015版）（以下简称《中国药典》）第一部]

1.背景简介

中药材甘草为豆科植物乌拉尔甘草（Glycyrrhiza uralensis Fish.）、胀果甘草（Glycyrrhiza inflate Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根及根茎。甘草在本草纲目草部中排位第一，具有补脾益气、清热解毒、润肺止咳、缓急止痛、调和诸药的作用。现代药理研究证明，甘草具有抗炎、抗变态反应、抗溃疡、抗HIV、诱生干扰素、调节细胞免疫功能、抗癌等作用，在医药、食品、饮料、烟草、化工、酿造、国防等行业有着极其广泛的应用。

依据《中国药典》（2015版），甘草及其制品的含量通常以甘草酸及甘草苷计，文献研究亦表明，甘草的主要化学成分为三萜类和黄酮类化合物，而甘草酸和甘草苷分别是这两类化合物的代表，两者是甘草中的主要有效成分，因此，甘草酸及甘草苷的含量常用于评价药材和成药的质量、制剂稳定性的优劣等。同时，甘草因产地、栽培方法、生长环境和采收季节的不同，其成分及含量相差很大，甘草酸和甘草苷的含量测定也成为野生与栽培甘草确定最佳采收期的重要依据。所以，分析甘草中甘草酸和甘草苷的含量对于评定甘草的内在品质，进而建立甘草的现代质量评价体系、有效开发利用甘草资源都具有十分重要的意义。

2.方法的选择

甘草苷和甘草酸的分析方法很多，主要有比色法、薄层色谱法、离子抑制色谱法、高效液相色谱法及气相色谱法等。研究表明，香草醛-浓硫酸显色后的比色法测定的是水溶性三萜皂苷的含量，但由于甘草黄酮类干扰物质在254nm附近均有强烈的吸收，会导致含量偏高，误差比较大；而薄层色谱或聚酰胺吸附等手段尽管可将甘草酸和甘草苷从甘草提取物体系中分离出来再进行检测，但会导致操作的复杂化。与其他分离方法相比，HPLC具有柱效高、灵敏度高、分离速度快、适用范围广、重复性好、操作方便等优点，已是中草药化学研究中不可缺少的主要分离方法之一。所以，近几年来，在甘草苷和甘草酸的测定过程中，以高效液相色谱法应用最为广泛。

《中国药典》2015版一部对中药材甘草中甘草苷和甘草酸含量的检测采用液相色谱法，以70%乙醇溶液溶解甘草粉末，超声提取后，液相色谱分离，紫外检测器于波长237nm处检测，外标法定量。

3.提取方法

甘草研磨成粉，过三号筛，称取过筛后粉末约0.2g（精确至0.01g），置于具塞锥形瓶中，准确加入100mL 70%的乙醇溶液，加塞后称定重量。超声处理（功率250W，频率40kHz）30min，冷却至室温，再称定重量，用70%乙醇补足减失的重量，摇匀过滤，取滤液待测。

同时制备对照品溶液，取甘草苷对照品、甘草酸铵对照品适量，精密称定，加70%的乙醇溶液分别制成每1mL含甘草苷20μg、甘草酸铵0.2mg的溶液，待测。

4.仪器检测方法

采用以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂色谱柱，柱内径一般为3.9～4.6mm，填充剂粒径为3～10μm。流动相A为乙腈，流动相B为0.05%磷酸溶液，梯度洗脱程序如下：0～8min，流动相A保持19%，8～35min流动相A由19%变为50%；35～36min，流动相A由50%变为100%；36～40min，流动相A由100%变为19%。流速为1mL/min，进样量为10μL。采用上述色谱条件分别对试样溶液、对照品溶液和空白试验溶液进样检测。

注意事项：

① 采用本体系进行实验前，必须进行系统适用性试验。其中色谱柱的理论塔板数要求以甘草苷计算不低于5000。

② 甘草酸的含量以甘草酸铵的量进行折算，即：

③ 调整流动相组分比例时，当小比例组分的百分比例X≤33%时，允许改变范围为0.7X～1.3X；当X＞33%时，允许改变范围为X-10%～X+10%。

④ 若需使用小粒径（约2μm）填充剂，输液泵的性能、进样体积、检测池体积和系统的死体积等必须与之匹配；如有必要，色谱条件也应作适当的调整。当对其测定结果产生争议时，应以药典甘草品目规定的色谱条件的测定结果为准。

5.定量结果计算

甘草苷或甘草酸的质量分数可按如下公式计算：

式中　ω1——试样中甘草苷或甘草酸铵的质量分数，%；

V——试样定容体积，mL；

cs——对照品溶液中甘草苷或甘草酸铵的浓度，mg/mL；

A——试样溶液中甘草苷或甘草酸的峰面积；

As——对照品溶液中甘草苷或甘草酸的峰面积；

m——试样质量，mg；

ω2——样品干燥减量的含量，%。

实验结果以平行测定结果的算术平均值为准（保留一位小数）。在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不大于算术平均值的5%。

说明：由于对照品甘草酸铵在该流动相条件下，以甘草酸的形式进行分离，故公式中峰面积均指甘草酸的峰面积，但质量浓度按甘草酸铵计算，所以，最终甘草酸含量计算时仍需要进行折算。此外，甘草酸以18-α和18-β两种形式存在，通常的含量计算以18-β分量计算。

6.应用特点

甘草是我国最大量的常用中药材之一，但近年来随着甘草野生资源日益枯竭，种植甘草基本取代野生品种。由于种植甘草的条件、品种差异较大，甘草质量的检测日益为人们所重视。通过HPLC法对甘草中的主要药效成分甘草苷和甘草酸进行检测，为甘草品质的指标控制提供了依据。同时，本方法对色谱柱规定了以甘草苷为标准的理论塔板数要求，为使用者正确挑选合适的色谱柱进行甘草药效成分的分离提供了便利，也确保本方法的色谱分离条件在不同实验室的顺利进行。

（二）左氧氟沙星中主成分含量及杂质分析（参考《中国药典》2015版）

1.背景介绍

氧氟沙星为第三代喹诺酮类抗菌药，对葡萄球菌、链球菌、肺炎链球菌、淋球菌、大肠杆菌、枸橼酸杆菌、志贺杆菌、肺炎克雷伯杆菌、肠杆菌属、沙雷杆菌属、变形杆菌、流感嗜血杆菌、不动杆菌、螺旋杆菌等有较好的抗菌作用，可用于治疗由上述菌所致的呼吸道、咽喉、扁桃体、泌尿道（包括前列腺）、皮肤及软组织、胆囊及胆管、中耳、鼻窦、泪囊、肠道等部位的急、慢性感染。氧氟沙星通常为左旋体和右旋体的混合物，研究表明，氧氟沙星的左旋体（左氧氟沙星）的抗菌效力高于右旋体，是氧氟沙星的2～8倍，且不良反应明显小于右旋体，因此临床上应用极为广泛。

从制药角度出发，相关药物的杂质不仅无效，而且可能危害人体健康或影响药物的稳定性，甚至导致不可预料的不良反应，因此将杂质控制在一个安全、合理的限度范围内对于药品的质量而言极其重要。所以，左氧氟沙星药物中主成分的纯度越高，药物的抗菌效果越好。但是，在化学合成过程中必然会产生光学异构体的副产物——右氧氟沙星，鉴于右氧氟沙星几乎没有抑菌作用，故对包括右氧氟沙星在内的光学异构杂质进行控制直接关系到左氧氟沙星药品的质量。《中国药典》2015版二部中明确规定了左氧氟沙星制剂中相关杂质、右氧氟沙星及左氧氟沙星含量的测定方法，对该类药物的质量控制提供了标准依据。图1-27为左氧氟沙星及相关物质的结构图。

2.方法的选择

左氧氟沙星的分析方法主要有微生物抑制法、HPLC和LC-MS/MS等。微生物抑制法相对较为简单，但结果的确定性稍差，经常用于药物类别的快速筛查。LC-MS/MS法灵敏度高，选择性强，定量定性准确，仪器价格及维护要求较高，在残留量水平的左氧氟沙星检测中应用较多。与LC-MS/MS法相比，HPLC法区分异构体能力强，定量能力出色，流动相类别选择范围更宽，仪器普及率高，在物质主成分分析中应用更多，据统计，约70%的药物标准中含量测定采用HPLC方法。因此，测定药品左氧氟沙星中主成分含量选择HPLC法较为合适。

《中国药典》2015版二部中对于左氧氟沙星的含量及相关物质的检测采用HPLC法，通过盐酸溶液溶解药品，利用色谱分离过程将左氧氟沙星和右氧氟沙星及相应杂质区分，分别用对照品加以定性、定量，确定药品中各成分的含量水平。

3.左氧氟沙星的测定

（1）溶液配制　称取药品约50mg（精确至0.1mg），置于50mL容量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释至刻度，摇匀。量取5mL，置于另一个50mL容量瓶中，用0.1mol/L盐酸溶液稀释至刻度，摇匀，待测。

同时，称取左氧氟沙星对照品适量，加0.1mol/L盐酸溶液溶解并定量稀释制成0.1mg/mL的左氧氟沙星对照品溶液，待测。

（2）仪器检测方法　采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵4.0g和高氯酸钠7.0g，加水1300mL使溶解，用磷酸调节pH值至2.2）-乙腈（85∶15）为流动相；检测波长为294nm，进样量为10μL。最终将样品溶液和对照品溶液分别进样，以外标法定量。

由于左氧氟沙星与环丙沙星及杂质E出峰接近，因此使用本方法对左氧氟沙星进行分离检测前必须用相应对照品进行系统适用性验证，验证符合要求后方可进行检测。验证过程如下：称取左氧氟沙星对照品、环丙沙星对照品和杂质E对照品各适量，用0.1mol/L盐酸溶液配制成含0.1mg/mL左氧氟沙星、5μg/mL环丙沙星和5μg/mL杂质E的溶液，采用上述液相条件进行色谱分离并检测。如果左氧氟沙星与杂质E和左氧氟沙星与环丙沙星色谱峰之间的分离度分别大于2.0与2.5，则该液相条件符合检测要求，如果分离度未达到要求，则需要调整色谱柱的长度半径及流动相的比例使分离度符合要求。

4.右氧氟沙星的测定

（1）溶液配制　称取药品适量，以硫酸铜+D-苯丙氨酸溶液-甲醇（82∶18）混合溶液配制成1.0mg/mL的样品溶液。同时对样品溶液进一步稀释，获得10μg/mL的对照溶液；然后取对照溶液适量稀释，获得0.5μg/mL的灵敏度溶液。其中样品溶液和对照溶液用于右氧氟沙星的含量测定，灵敏度溶液用于系统适用性验证。

（2）器检测方法　采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱；以硫酸铜D-苯丙氨酸溶液（取D-苯丙氨酸1.32g与硫酸铜1g，加水1000mL溶解后，用氢氧化钠试液调节pH值至3.5）-甲醇（82∶18）为流动相；柱温40℃，检测波长为294nm。进样量20μL。

（3）系统适用性验证　称取左氧氟沙星和右氧氟沙星对照品各适量，用上述流动相制成含1mg/mL左氧氟沙星和20μg/mL右氧氟沙星的溶液，按上述仪器检测条件进行检测，要求右氧氟沙星与左氧氟沙星依次流出，右、左旋异构体峰的分离度应符合要求。此外，取灵敏度溶液20μL按上述条件进行分析，应确保主成分色谱峰峰高的信噪比大于10。

注意：系统适用性验证必须符合要求方可进一步进行测定，如果验证结果不符合要求，则需要调整液相色谱的部分条件。

5.其他杂质的检测

（1）提取方法　称取药品适量，用0.1mol/L盐酸溶液配制成1mg/mL的溶液，作为样品溶液；取部分样品溶液，进一步用0.1mol/L盐酸溶液稀释，获得2μg/mL的溶液，作为对照溶液；再取对照溶液适量，用0.1mol/L盐酸溶液稀释成每0.2μg/mL的溶液，作为灵敏度溶液。

另称取杂质A对照品约15mg（精确至0.1mg），置于100mL容量瓶中，加6mol/L氨水溶液1mL与水适量溶解，用水稀释至刻度，摇匀；取2mL该溶液，置于另一个100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为杂质A的对照品溶液。

（2）仪器检测方法　采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，以醋酸铵高氯酸钠溶液（取醋酸铵4.0g和高氯酸钠7.0g，加水1300mL使溶解，用磷酸调节pH值至2.2）-乙腈（85∶15）为流动相A，乙腈为流动相B；按表1-5进行梯度洗脱。柱温为40℃；流速为每分钟1mL。

系统适用性验证过程同3（2）。此外，灵敏度溶液按照上述液相色谱条件进行检测，进样量10μL，以294nm为检测波长，主成分色谱峰峰高的信噪比应大于10。

将样品溶液、对照溶液和杂质A对照品溶液按上述条件进行检测，进样量均为10μL，分别以294nm和238nm为检测波长。药典对左氧氟沙星药品的质控要求为：样品溶液中如有杂质峰，杂质A（238nm检测）按外标法以峰面积计算，不得过0.3%，其他单个杂质（294nm检测）峰面积不得大于对照溶液主峰面积（0.2%），其他各杂质（294nm检测）峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍（0.5%）。供试品溶液色谱图中小于灵敏度溶液主峰面积的峰忽略不计。

6.应用特点

本应用针对氧氟沙星的异构体及主要杂质进行检测，充分发挥了HPLC的优势。在左旋体和右旋体的分离以及氧氟沙星与杂质的分离过程中使用了不同的流动相，通过不同盐类的加入，确保不同的分离目的都能实现。同时本应用强调了系统适用性验证，以不同组分的分离度为标准保证液相色谱条件在不同实验室均能获得良好的实验结果。依照可适当对色谱柱和流动相比例进行调整的原则，也给实际使用提供了应用的便利。

（三）尿中2-硫代噻唑烷-4-羧酸的测定（参考WS/T 40—1996）

1.背景简介

在现代化工业体系中，二硫化碳不仅是一种重要的化工原料，可用于生产粘胶纤维、玻璃、人造丝、赛璐玢、四氯化碳、农药杀菌剂、橡胶助剂等，而且还是一种优良的有机溶剂，可作为羊毛去脂剂、衣服去渍剂、金属浮选剂、油漆和清漆的脱膜剂、航空煤油添加剂等在油脂生产、蜡、冶金、船舶和航空领域应用。但是，二硫化碳本身具有毒性，轻度中毒会有头晕、头痛、眼及鼻黏膜刺激症状，一旦重度中毒可呈短时间的兴奋状态，继之出现谵妄、昏迷、意识丧失，伴有强直性及阵挛性抽搐，可因呼吸中枢麻痹而死亡。而长期接触人员会引发中枢神经系统以及心血管系统的损伤。目前，一些国家如美国、日本等规定大气中CS2的最高容许浓度为30mg/m3，我国则规定在CS2车间空气中最高容许浓度为10mg/m3。所以，通过检测手段判别人体接触二硫化碳的程度对于保护工业生产中职业接触人员的健康具有重要的意义。

1981年，Van D.R.等从接触二氧化硫的工人尿中分离到2-硫代噻唑烷-4-羧酸（TTCA），此后的研究表明，TTCA是二硫化碳在体内与谷胱甘肽结合所生成的特异性代谢产物，CS2被人体吸入后大约有0.7%～2.3%在体内转化为TTCA。因此，目前国内外已公认采用接触工人尿中TTCA含量作为接触CS2的生物监测指标，所以，对尿中TTCA的检测已成为CS2职业接触人员职业健康监护的重要技术手段。

2.方法的选择

由于CS2通过呼吸道或皮肤摄入体内后，尿中的代谢产物是硫酸盐和对碘叠氮基反应具有阳性的物质，因此，对尿液中有机硫代谢产物的检测曾采用碘叠氮实验法，但该法灵敏度低，且无法用于空气中CS2浓度为20mg/L以下的接触者，实用性较差。1981年，Van D.R.等最初选择了HPLC作为TTCA的检测方法，之后的研究表明，对于10mg/L浓度以下（常规CS2使用车间的浓度水平）的接触人群而言，HPLC法可以准确灵敏地监测相应人员尿中的TTCA含量，所以，目前HPLC法是医药卫生领域对尿中TTCA监测的主要方法。

中国卫生行业标准WS/T 40—1996规定了尿中TTCA的高效液相色谱测定方法，方法的最低检测浓度为8μg/L，适用于接触CS2人员尿中TTCA的测定。该方法借助盐酸酸化尿样，用乙醚提取TTCA，液相色谱分离，紫外检测器测定，外标法定量。

3.尿中TTCA的测定

取1mL尿样，加入0.1mL 2mol/L盐酸溶液及5mL乙醚，振荡提取2min，3000r/min离心10min后取乙醚层，于40℃水浴氮吹至干，用200μL甲醇复溶。同时配制系列标准溶液。

采用反相C18键合硅胶色谱柱，流动相为甲醇+水+冰醋酸（14.5+84.5+1），流速1.5mL/min，紫外检测波长为273nm，进样体积20μL。将样品与标准溶液依次检测（图1-28）。

按照公式将尿样换算成标准相对密度下浓度的校正系数：

式中，实测相对密度为样品用尿比重管测定的值。

按照公式计算尿中TTCA的浓度：

式中　X——尿中TTCA的浓度，mg/L；

c——从标准曲线上算得的TTCA浓度，μg/20μL。

注意事项：质控样必须考虑本底值，防止结果整体误差。尿样量取前如有浑浊，需离心后再取，经乙醚提取后务必再次离心，确保分层清晰，转移完全。

4.应用特点

鉴于尿液中含有众多代谢物质，本方法用酸性乙醚提取，可以去除一些干扰杂质；同时利用等度洗脱，简化了应用模式，只需要一个泵即可进行检测，利于推广。但对于有条件的机构，也可以恢复成双泵，梯度洗脱模式，增加了方法整体的灵活性。该方法用于现场及时检验，简便、灵敏、选择性好。