第二节　高效液相色谱仪器的基本结构及发展

一、高效液相色谱仪器的基本组成

自1969年首次出现以来，随着应用范围的不断拓展，高效液相色谱（简称HPLC）仪器的发展十分迅猛，其仪器结构和流程也多种多样。典型的高效液相色谱仪基本由高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统和数据处理系统五个部分组成，如图1-2所示。下面将分别叙述其各自的组成与特点。

（一）高压输液系统

HPLC使用的色谱柱是很细的（1～6mm），所用固定相的粒度也非常小（几微米到几十微米），所以流动相在柱中流动受到的阻力很大，在常压下，流动相流速十分缓慢，柱效低且费时。为了达到快速、高效分离，必须给流动相施加很大的压力，以加快其在柱中的流动速度，因此，须用高压泵进行高压输液。所以高压输液系统对于现代HPLC而言是至关重要的。高压液相色谱仪的高压输液系统通常由过滤器、贮液装置、脱气装置、高压泵、压力脉动阻尼器、梯度淋洗装置等组成。

1.过滤器

在HPLC体系中一旦有任何颗粒物进入，都会对高压泵或单向阀造成损害，并堵塞输液管路或色谱柱，最终导致系统压力增加并使色谱峰变形。因此，为了防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，延长仪器和色谱柱的使用寿命，提高数据的可靠性，在流动相进入HPLC系统前通常需要经过过滤器。常用过滤装置是孔径为5～10μm的下沉式过滤器，位于连接贮液瓶和泵的输液管的末端进口处，常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属过滤筒两种。

注意事项：过滤器的设计只能除去系统中的尘土并保证贮液瓶、输液管使用的可靠性，并不能取代流动相的过滤步骤。如果流动相均由高效液相色谱级的溶剂组成，那么，流动相可以不用过滤。由于高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2μm微孔滤膜过滤。同样的，无论是HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。但是，假如有任何一种缓冲液中加进了固体物，例如磷酸盐，就必须进行流动相的过滤。虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边沿挤压就会产生塑料颗粒。在这种情况下，添加的固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒仍然会存在于流动相中成为残渣。过滤步骤通常采用流动相通过0.45μm微孔滤膜过滤进行。

2.贮液装置

用来贮存液体流动相，一般是玻璃或不锈钢容器，体积在0.5～2L为宜，对于凝胶色谱仪、制备型色谱仪，则体积可以更大些。贮液瓶要求能承受一定压力，耐腐蚀，易于脱气操作。通常贮液容器应放置于高于泵体的位置，以便保持一定的输液压力差。简单的贮液容器为500mL透明或棕色试剂瓶，盖严，防止溶剂挥发或空气中氧气等引起流动相组成发生改变。

3.脱气装置

流动相进泵前必须脱气，尤其是水和极性溶剂，以除去其中溶解的气体（如氧气等）。否则过柱后由于压力降低，溶解的气体会逸出形成气泡，这些气泡对于多种检测器都会造成不良的影响，如在低死体积检测池中，气泡会增加基线噪声，进而降低检测器的灵敏度，而对于荧光检测器，溶解在流动相中的氧气将会造成荧光猝灭效应，影响荧光检测器的检测。

目前，商品化的HPLC仪器一般装有流动相在线脱气设备，如微型真空泵在线脱气，通常采用将真空脱气设备串联到贮液系统中，并结合膜过滤器的方式实现连续脱气，以脱除溶解在液体中的空气，防止溶解气在柱后由于压力下降而脱出，形成气泡，影响检测器正常工作。

离线的脱气方式也经常应用，比较常见的有超声波脱气法、低压脱气、吹氦脱气和加热回流等。

超声波脱气法：将溶剂贮瓶置于超声波水浴中，脱气15～20min，这是目前使用最广泛的脱气方法。

低压脱气又称为抽真空脱气，使用微型真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去流动相中溶解的气体，该法对单一溶剂体系脱气较为适宜，多元溶剂建议先进行脱气后再混合，防止真空体系对混合溶剂的组成造成影响。

吹氦脱气法利用氦气在液体中的溶解度小于空气的特点，在0.1MPa压力下，用一定流速（如60mL/min）将氦气通入流动相10～15min，即可除去流动相中溶解的空气。该法因使用氦气，成本较为昂贵，但脱气效果较好。

4.高压输液泵

高压输液泵是高效液相色谱仪中的关键部件之一，其功能是将贮液容器中的流动相以高压形式连续不断地送入液路系统，使样品在色谱柱中完成分离过程。由于液相色谱仪所用色谱柱径较细，所填固定相粒度很小，因此，对流动相的阻力较大，为了使流动相能较快地流过色谱柱，就需要高压泵注入流动相。因此，HPLC系统对泵有如下要求：输出压力高，流量范围大，流量恒定，无脉动，流量精度和重复性为0.5%左右，此外，还应耐腐蚀，密封性好。

高压输液泵，按其性质可分为恒压泵和恒流泵两大类。恒流泵是能给出恒定流量的泵，其流量与流动相黏度和柱渗透无关。恒压泵是保持输出压力恒定，而流量随外界阻力变化而变化，如果系统阻力不发生变化，恒压泵就能提供恒定的流量。

高压输液泵，按机械结构可分为液压隔膜泵、气动放大泵、螺旋注射泵和往复柱塞泵四种，其中液压隔膜泵和气动放大泵为恒压泵，而螺旋注射泵和往复柱塞泵则属于恒流泵。

（1）液压隔膜泵　这种泵的特点是制备工艺要求低，高压密封易解决。缺点是排吸液切换时压力波动较大。其结构如图1-3所示。

（2）气动放大泵　这种泵是输出恒定压力的泵，结构如图1-4所示。其利用气体的压力驱动和调节流动相的压力。工作时，以压缩空气作为动力驱动汽缸中横截面积大的活塞，再经过一个连杆驱动液缸中横截面积小的活塞，借助两个活塞面积的差异，获得输出液的高压。

使用气动放大泵时，输出流动相的流量不仅由泵的输出压力决定，还取决于流动相的黏度及色谱柱的长度、固定相粒度和填充情况，因此在实际过程中无法获得稳定的流量。

气动放大泵的优点是制备容易，操作时压力稳定无波动，但由于其不易进行流量调节，无法用于梯度淋洗，目前常常用于装柱。

（3）螺旋注射泵　这种泵为输出恒定体积流量的流动相，其工作原理（图1-5）是利用齿轮螺杆传动至步进电动机，带动活塞以恒定的速度移动，在高压的状态下将流动相以恒定流速输出。

螺旋注射泵的优点为流量稳定，操作方便，可与多种高灵敏度检测器连接使用。其可在高压状态下提供精确（0.1%）、无脉动、可重现的流量，并可通过改变电动机的电压，控制电机转速，改变活塞的移动速度，进而调节流动相的流量。这种泵的缺点是间断式供液，更换溶剂时清洗不便，尽管可采用双缸结构解决间歇供液的问题，但不易清洗的问题仍无法解决，目前多用于超临界流体色谱中。

（4）往复柱塞泵　这是HPLC中应用最多的泵，其结构如图1-6所示。常见的往复柱塞泵为双柱塞并联泵，通常由电动机带动凸轮或偏心轮转动，驱动活塞杆做往复式运动，借助单向阀的开关，定期将贮存在液缸里的液体以高压连续输出。需要改变输出液体的流量时，可以通过改变电动机的转速、调节活塞冲程的频率来实现。

往复柱塞泵的优点在于维持高压状态下的连续恒定的流量，且由于柱塞尺寸小、易于密封，柱塞、单向阀的阀球和阀座可使用人造红宝石材料，更换溶剂便利，尤其适合于梯度洗脱。其缺点在于恒流状态下仍存在脉动，对于敏感的接测器而言，会引起基线波动；此外，柱塞直接与流动相接触，会造成污染，且长期运转过程中，单向阀的阀球易因磨损而不能正常关闭单向阀。

5.压力脉动阻尼器

由于高压输液泵输出的流动相具有一定脉动，而很多检测器对流动相流速波动比较敏感，为了获得稳定的基线，所以HPLC仪器中常常会在泵的出口与色谱柱的入口安装一个压力脉冲阻尼器。阻尼器由螺旋毛细管、波纹管等组成。

6.梯度淋洗装置

通常情况下，液相色谱中的流动相组成和比例是恒定的，这种洗脱化合物的方式被称为等度洗脱；但是为了改善分析结果，某些操作需要连续改变流动相中各溶剂组分的比例以连续改变流动相的极性，使每个分析组分都有合适的容量因子k，并使样品中的所有组分可在最短时间内实现最佳分离，这种洗脱方式称为梯度洗脱。目前，梯度洗脱已在HPLC中获得广泛的应用，主流的仪器都配备梯度洗脱装置。

梯度洗脱可分为低压梯度和高压梯度两种方式，如图1-7所示，具体介绍如下：

（1）低压梯度装置　该梯度模式又称为泵前混合，在常压下按照一定的程序将溶剂预先进行混合后再由高压输液泵输入色谱分离系统。目前最常用的方式是通过电磁比例阀控制流动相的混合，借助控制器程序即可得到任意混合浓度的曲线。这种装置的主要优点是仅需要一个高压输送泵。图1-8是四元低压梯度系统示意图。这一系统最多可同时有四个流动相进入流路，按照预先设定的配比进行混合，依靠电磁阀的快速切换使泵分段输送不同流动相，可以做梯度洗脱。在仪器上进行设定之后，在同一样品分析过程中，相隔一段时间后，按照用户的设定自行改变流动相配比，将样品中组分分离开来。

低压梯度的混合比例是通过控制不同流路的电磁阀的开闭时间长短来控制的，理论上混合的比例是准确的，但是实际上电磁阀的开闭会有一个延迟，从而对混合的比例造成影响，尤其是比例相差很大时（如99∶1），在低比例流路的电磁阀延迟的时间可能比电磁阀工作的时间还要长，就会直接影响混合的效果，这也是低压梯度混合的缺陷。

（2）高压梯度装置　高压梯度模式通常采用泵后混合，由两个或两个以上高压输液泵分别将两路或两路以上极性不同的溶剂输入混合器，经充分混合后进入色谱分离系统。其优点在于不同流路的流动相各自由独立的高压输液泵控制，可以获得任何形式的梯度程序，并易于实现自动化。

与低压梯度模式相比，泵后混合时溶剂的可压缩性及热力学体积的变化可能会影响输入到色谱柱中的流动相的组成。但多个泵并联，按照预先设定的配比分别送液到泵后的混合室内，在高压下进行混合，混合配比更准确，不易产生气泡，不用为了转换流动相而反复清洗，不仅节省溶剂，也提高了工作效率，无需增加真空脱气机，降低了混合死体积（泵前混合时、混合管、泵头等体积，脱气机内死体积都不可避免）。目前常见的为二元高压梯度装置，其适合于成分复杂的样品分析和重现性较高的测定。

（二）进样系统

进样系统是将试样送入色谱柱的装置。依据“无限直径效应”，如果样品以柱塞式注入色谱柱，因柱的阻力大，样品分子在柱中的分子扩散很小，就能保持高柱效，因此在HPLC体系中强调进样时应将样品定量地快速注入至色谱柱上端的填料中心，形成比较集中的一点。此外，液相色谱仪进样系统要求进样重复性好；进样器死体积小；由进样引起色谱峰扩张小；密封性能好，不得出现泄漏、吸附、渗透，进样时系统压力、流量波动小等。

目前液相色谱仪进样主要有两种方式：一类是手动进样；另一类是自动进样。无论是手动还是自动进样，一般都借助阀进样装置来完成进样操作。图1-9为常见的六通阀进样装置示意图。

采用阀装置进样的柱效比直接加样品在色谱柱上的方式下降5%～10%，但其重复性好，耐高压。

自动进样一般是将六通阀配上样品传送系统、取样系统和程序控制器，由程序控制取样针从样品瓶中自动吸取样品，从1处注入色谱系统，于色谱分析的同时完成洗针和复位动作。自动进样装置的样品量可连续调节，进样重复性高，适合于大量常规样品的分析。

手动进样阀的实物如图1-10所示，LOAD阀位为装填样品状态，注入样品后，将阀旋转到INJECT位置，实现进样。样品的注入方式一般分为满环注入和部分注入两种。满环注入时，要求用比定量环体积稍多的样品量注入环路，保证定量环满环进样，这种方式重现性较好。部分注入方式通常是在以定量环容量作为最大范围的前提下，通过微量注射器定量注入所需体积的样品量，这种方式的重现性受到微量注射器的计量误差影响，但在注射同一浓度的标准试样作标准曲线时应用便利。

与自动进样相比，手动进样在平时使用时需要特别注意操作和维护，如果使用方法不当易出现谱图变异、标线无线性、漏液等现象。故在使用时需要注意如下事项：

① 手柄处于LOAD和INJECT之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位时，过高的压力会对柱头造成损伤，所以应尽快转动手柄，不能停留在中途。

② 部分注入方式进样时，进样量一般最多为定量环容量的75%；满环注入方式时，进样量以能完全置换定量环内残留的溶液量为准，一般为定量环容量的3～5倍。

③ 样品溶液均要用滤膜过滤，防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。

④ 注意进样针外壁的清洗，防止交叉污染。

⑤ 每次用完后应冲洗进样管路，通常用适当的有机溶剂、水或不含盐的流动相冲洗，尤其是LOAD和INJECT阀位。

（三）分离系统

分离系统是HPLC的重要部分，该系统包括色谱柱、连接体系和恒温系统组成。根据分析的目标物，选择适合的色谱分离系统，可以提高分离效果。

1.色谱柱

（1）色谱柱的管材尺寸　色谱柱采用优质不锈钢管、硬质玻璃管或钛合金等材料作为管材。不锈钢耐腐蚀、易纯化、耐高压，但其内表面光洁度对柱效影响很大。柱管内若有纵向沟痕或表面不均匀，会引起色谱峰区带扩张，降低柱效。因此，通常需要对不锈钢管材进行内壁抛光，并以HNO3作钝化处理。标准填充柱的长度为10～50cm（需要两根联用时，可在二者之间加一连接管），柱管内径为2～5mm，填料粒径5～10μm，柱效达5000～10000块/m理论塔板数。如使用3～5μm粒径的填料，则柱长通常为5～10cm。如使用内径为0.5～1.0mm或30～50μm柱管时，柱长为15～50cm；如果用于半制备或制备色谱，一般柱管内径需6mm以上。

（2）色谱柱的填料　填料是色谱柱的核心，填料的品种、粒径的形状、大小对分离都有明显影响。填料的粒径一般为5～10μm，通常是由机械强度高的树脂或硅胶构成。这些材料须具有惰性（如硅胶表面的硅酸基团基本已除去）、多孔性和比表面积大的特点，同时其表面经过机械涂渍，或者是化学键合各种基团（如磷酸基、季铵基、羟甲基、苯基、氨基或各种长度碳链的烷基等）或配体的有机化合物。因此，这类填料对结构不同的物质有良好的选择性。例如，在多孔性硅胶表面偶联豌豆凝集素（PSA）后，就可以把成纤维细胞中的一种糖蛋白分离出来。

目前，以化学键合固定相的填料在HPLC中最为常见。这种填料以硅胶为基质，采用有机硅烷等与硅胶表面进行化学键合反应，形成Si—O—Si—C键型或Si—O—C键型。它们结构稳定，耐水，耐光，耐有机溶剂，能在70℃以下使用，pH范围2～8，是性能最佳、应用最广的固定相。

相比于常规涂渍固定相，化学键合固定相具有如下优点：

① 寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击，耐水，耐光，耐有机溶剂，稳定；

② 传质快，表面无液坑，比一般液体固定相传质快；

③ 选择性好，可键合不同官能团，提高选择性；

④ 有利于梯度洗脱。

（3）色谱柱的填充　色谱柱填充质量的好坏直接影响填充柱的柱效，因此，色谱柱的填充方式及效果对于HPLC体系而言也是极其重要的。一根填充质量较高的色谱柱，通常其理论塔板数应该达到2000～3000块/m，根据固定相填料粒径的大小，可分为湿法装柱和干法装柱两种。一般粒径大于20μm的（多用于制备色谱），可用干法装柱，而粒径小于10μm的，由于随着粒径的缩小，静电作用和表面能的加大，粒子间倾向于聚集和“黏结”，若以干法填装，它们会黏附在连接管及柱壁上，也会因强烈的静电作用彼此排斥，因而难以填装出均匀而紧密的柱床。所以必须改以湿法装填，即将填料悬浮于适宜的液体中消除上述不良作用。

干法装柱是直接往柱管里填入硅胶，然后再轻轻敲打柱子两侧，至硅胶界面不再下降为止，然后填入硅胶至合适高度，最后再用油泵直接抽，这样就会使得柱子装得很结实。接着是用淋洗剂“走柱子”。但需注意的一点是，在干法填装制备液相色谱柱时，不要过分剧烈地振动和敲打。振动和敲打会使填料因自身粒径的不均匀性而产生柱子整体上的不均一性，即较大的填料粒子靠近柱壁，而较细粒径者则倾向集中于柱中心。这种柱内颗粒分布的不均匀性，会导致柱效的降低。比较好的方法是采用少量多次的方法向柱内加入填料，例如每次加入相当于3～5mm柱床的填料，装一点即垂直地轻轻磕几十下，续加一些填料后，重复上述操作，直至填装完成。

湿法装柱又称匀浆装填法。一般是先把硅胶填料用适当溶剂拌匀后，装填入柱管中，然后再加压用淋洗剂“走柱子”。湿法装柱的关键在于克服在固-液系统中存在因重力而引起的沉降现象，通常采用如下三种方式：①设法寻找与硅胶密度相近的溶液，降低沉降速度；②增加液体的黏度以阻止粒子的下沉；③综合利用前两种方法，尽力减小沉降并尽快地在发生较显著的沉降之前完成装柱操作。湿法装柱的最大优点是色谱柱装得比较结实，没有气泡。

2.连接体系

色谱柱需要通过适当的连接与HPLC仪器形成完整的体系。色谱柱管与柱接头通过过滤片连接，过滤片一般用多孔不锈钢烧结材料，孔径小于填料的粒径，这样既阻挡了流动相中的极小颗粒进入色谱柱，又能保证流动相顺利通过色谱柱。

此外，为了减小死体积和色谱峰的展宽，HPLC体系中的连接管均为内径0.1～0.3mm的不锈钢管或PEEK管，并且应使用尽可能短及较小内径的管路进行连接。

在色谱柱的连接中，有些体系会使用保护柱（预柱）来防止因流动相和样品中的不溶性颗粒堵塞色谱柱的危害。这种保护柱一般连接在进样器和色谱柱之间，装有填料或过滤片，常被用于去除预处理过程后残留的蛋白质、多糖等成分。如果使用有填料的保护柱，要求选择和分析柱性能相同或相近的填料，但其对峰的保留时间会有影响。无填料的保护柱一般是利用筛板的过滤作用，效果不如有填料的保护柱。

3.恒温器

柱温可以影响色谱分离效率。一般情况下，提高柱温可以降低流动相的黏度，增加样品在流动相中的溶解度，减小溶质的保留值。常用的柱温控制范围为室温至65℃之间。多数样品在室温条件下即可进行分析，但恒定的柱温可以提高保留时间值的重现性，因此在室温变化大的实验室配置恒温箱是很有必要的。目前，商品化的HPLC仪器的恒温装置多采用空气循环箱恒温和色谱套柱加热恒温。

（四）检测系统

HPLC的检测系统是一种信号接收和能量转换的装置，其通过将色谱柱中流出物的组成和含量变化转化为可供检测的信号，实现定性定量的目标。高效液相色谱常用的检测器有很多，按照用途分类有通用型和选择型两类，其中通用型的检测器有示差折光、火焰离子化及电容等；而选择性检测器则有紫外吸收、紫外可见分光、荧光、化学发光、安培法、极谱法等。通用型检测器主要针对任何有机物都存在的物理量（如折射指数、介电常数）进行监测，具有广泛的适应性，但灵敏度相对较低。选择性检测大多针对被测物质的特异性响应进行检测，不会受流动相或操作条件变化的影响。

按检测性质分，检测器可分为浓度型和质量型，前者与溶质在溶液中的浓度有关，是一种测定总体性质的检测器，典型的有紫外吸收、示差折光和荧光等。后者则与待测物的质量有关，如氢火焰检测器、库伦检测器都属于质量型。

若按测量原理分，检测器又可分为光学检测器和电学检测器。

1.紫外可见吸收检测器

紫外可见吸收检测器（ultraviolet-visible detector，UV-Vis）是HPLC中应用最广泛的检测器之一，几乎所有的液相色谱仪都配有这种检测器。其作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。UV-Vis是最常用的检测器，对大部分有机化合物有响应。

UV-Vis检测器的特点如下：

a.灵敏度高，其最小检测量10-9g/mL，故即使对紫外光吸收很弱的物质，也可以检测；

b.线性范围宽（比尔定律）；

c.流通池可做得很小（1mm×10mm，容积8μL）；

d.对流动相的流速和温度变化不敏感，可用于梯度洗脱；

e.波长可选，易于操作，如，使用装有流通池的可见紫外分光光度计（可变波长检测器）。

缺点：对紫外光完全不吸收的试样不能检测；同时溶剂的选择受到限制。

紫外可见检测器的工作原理与结构同一般分光光度计相似，实际上就是装有流动池的紫外可见光度计。UV-Vis检测器可分为紫外吸收检测器和二极管阵列检测器两种。

（1）紫外吸收检测器　紫外吸收检测器（图1-11）常用氘灯作光源，氘灯则发射出紫外-可见区范围的连续波长，并安装一个光栅型单色器，其波长选择范围宽（190～800nm）。它有两个流通池，一个作参比，一个作测量用。光源发出的紫外光照射到流通池上，若两流通池都通过纯的均匀溶剂，则它们在紫外波长下几乎无吸收，光电管上接受到的辐射强度相等，无信号输出。当组分进入测量池时，吸收一定的紫外光，使两光电管接受到的辐射强度不等，这时有信号输出，输出信号大小与组分浓度有关。

UV-Vis检测器的局限为流动相的选择受到一定限制，即具有一定紫外吸收的溶剂不能作流动相。每种溶剂都有截止波长，当小于该截止波长的紫外光通过溶剂时，溶剂的透光率降至10%以下，因此，紫外吸收检测器的工作波长不能小于溶剂的截止波长。

（2）光电二极管阵列检测器　光电二极管阵列检测器（photodiode array detector，PDAD）也称快速扫描紫外可见分光检测器，是一种新型的光吸收式检测器（图1-12）。20世纪80年代中期，用一系列（1024个或512个）的光电二极管取代了传统的光电倍增管，在一次色谱操作中可同时获得多波长的吸光度，并且可以采用现代微机技术将各组分的保留时间、吸收波长和吸光度汇合到一起，绘制三维谱图，提供既定量又定性的色谱信息。它采用光电二极管阵列作为检测元件，构成多通道并行工作，同时检测由光栅分光，再入射到阵列式接收器上的全部波长的光信号，然后对二极管阵列快速扫描采集数据，得到吸光度（A）是保留时间（tR）和波长（l）函数的三维色谱光谱图。由此可及时观察与每一组分的色谱图相应的光谱数据，从而迅速决定具有最佳选择性和灵敏度的波长。

单光束二极管阵列检测器，光源发出的光先通过检测池，透射光由全息光栅色散成多色光，照射到阵列元件上，使所有波长的光在接收器上同时被检测。阵列式接收器上的光信号用电子学的方法快速扫描提取出来，每幅图像仅需要10ms，远远超过色谱流出峰的速度，因此可随峰扫描。

传统的紫外检测器每次进样只能完成单一波长扫描，而利用二极管阵列检测器可以在一次程序运行中进行190～800nm之间的全波长立体扫描，并可在数据采集完成后显示某一波长的色谱图。因此，可以实现利用被测物质的光谱吸收曲线的模式图形状、最大吸收波长、色谱峰纯度分析、导数光谱辅助定性及快速选择最佳检测波长等方面的优势，从而弥补利用单一紫外波长吸收进行色谱分析过程中单独采用色谱峰保留时间定性的不足，增强高效液相色谱定性分析能力。二极管阵列检测器与紫外可见吸收检测器的比较如表1-2所示，相比之下，PDAD在辅助定性上具有优势，可以弥补UV-Vis的不足，而UV-Vis的灵敏度较高，信噪比更出色。

2.示差折光检测器

示差折光检测器（differential refractive Index detector，RID）是一种浓度型通用检测器，对所有溶质都有响应，某些不能用选择性检测器检测的组分，如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃等，可用示差检测器检测。示差检测器是基于连续测定样品流路和参比流路之间折射率的变化来测定样品含量的。光从一种介质进入另一种介质时，由于两种物质的折射率不同，就会产生折射。只要样品组分与流动相的折射率不同，就可被检测，二者相差愈大，灵敏度愈高，在一定浓度范围内检测器的输出与溶质浓度成正比。

检测器的光路是由光源、凸镜、检测池、反射镜、平板玻璃、双光敏电阻等主要部件组成，检测池有参比，测量两个池室，它们对光路来说是串联的。光源通过聚光镜和夹缝在光栅前成像，并作为检测池的入射光，出射光照在反射镜上，光被反射，又入射到检测池上，出射光在经过透射镜照到双光敏电阻上形成夹缝像。双光敏电阻是测量电桥的两个桥臂，当参比池和测量池流过相同的溶剂时，使照在双光敏电阻的光量相同，此时桥路平衡，输出为零。当测量池中流过被测样品时，引起折射率变化，使照在双光电阻上的光束发生偏转，双光敏电阻值发生变化，此时由电桥输出讯号，即反映了样品浓度的变化情况。在偏转式示差折光检测器中，光路在通过两个装有不同液体的检测池时发生偏转，偏转的大小与两种液体之间折射率的差异成比例。光路的偏转由光敏元件上的位移测得，显示了折射率的不同（图1-13）。

在光学系统中采用多种精密装置，提高了运行的稳定性，也使检测器更加精致（图1-14）。从钨灯发出来的光束经过聚光透镜、狭缝1、准直镜和狭缝2，然后透过流通池，经零位玻璃调节器后在光敏元件上显示影像。

当检测池的样品和参比的折射率发生变化时，光敏元件上的影像水平移动，如图1-14所示，由光敏接收元件各自发出的电信号的变化与影像成比例。因此，可由两信号输出的差异获得与折射率的差异相对应的信号。

RID的优点在于绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RID是一种通用的检测方法。虽然其灵敏度与其他检测方法相比要低1～3个数量级，但对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的，所以其在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。其缺点主要是灵敏度很低，并且不能用于梯度洗脱系统。

3.荧光检测器

荧光检测器（fluorescence detector，FD）属于溶质型检测器，是一种高灵敏度、有选择性、可直接定量的检测器。FD利用光致发光的原理进行检测。研究表明，某些物质吸收了与它本身特征频率相同的光线以后，原子中的电子从基态中的最低振动能级跃迁到较高的振动能级。电子在同类分子或其他分子中撞击，消耗了相当的能量，从而下降到第一电子激发态中的最低振动能级，能量的这种转移形式称为无辐射跃迁。由最低振动能级下降到基态中的某些不同能级，同时发出比原来吸收的频率低、波长长的一种光，就是荧光。被化合物吸收的光称为激发光，产生的荧光称为发射光。荧光的波长总要大于分子吸收的紫外光波长，通常在可见光范围内。由于一个受激发的分子回到基态时可能以无辐射跃迁的形式产生能量损失，因而发射辐射的光子数通常都少于吸收辐射的光子数，以量子效率Q来表示。对可用荧光检测的物质来说，Q值一般在0.1～0.9之间。对于稀溶液，荧光强度与荧光物质溶液浓度、摩尔吸光系数、吸收池厚度、入射光强度、荧光的量子效率及荧光的收集效率等成正相关。在其他因素保持不变的条件下，物质的荧光强度与该物质溶液浓度成正比，这是荧光检测器的定量基础。

荧光涉及光的吸收和发射两个过程。任何能产生荧光的化合物，都需选择合适的激发光波长λEx，以利于检测。激发波长可通过荧光化合物的激发光谱来确定。激发光谱的具体检测办法是通过扫描激发单色器，使不同波长的入射光激发荧光化合物，产生的荧光通过固定波长的发射单色器，由光检测元件检测。最终得到荧光强度对激发波长的关系曲线，就是激发光谱。在激发光谱曲线的最大波长处，处于激发态的分子数目最多，即所吸收的光能量也最多，能产生最强的荧光。当考虑灵敏度时，测定应选择最大激发波长。一般所说的荧光光谱，实际上仅指荧光发射光谱。它是在激发单色器波长固定时，发射单色器进行波长扫描所得的荧光强度随荧光波长（即发射波长，λEm）变化的曲线。荧光光谱可供鉴别荧光物质，并作为荧光测定时选择合适的测定波长的依据。另外，由于荧光测量仪器的特性，使光源的能量分布、单色器的透射率和检测器的响应等性能会随波长而变，所以同一化合物在不同的仪器上会得到不同的光谱图，且彼此间无类比性，这种光谱称为表观光谱。要使同一化合物在不同的仪器上能得到具有相同特性的荧光光谱，则需要对仪器的上述特性进行校正。经过校正的光谱称为真正的荧光光谱。

综上所述，激发波长和发射波长是荧光检测的必要参数。选择合适的激发波长和发射波长，对检测的灵敏度和选择性都很重要，尤其是可以较大程度地提高检测灵敏度。但是，荧光的性质与分子结构有密切关系，不同结构的分子被激发后，并不是都能发射荧光。某些不发荧光的物质可通过化学衍生化生成荧光衍生物，再进行荧光检测。

与其他检测器相比，FD的最小检测浓度可达0.1ng/mL，适用于痕量分析；一般情况下FD的灵敏度比紫外检测器约高2个数量级，但其线性范围不如紫外检测器宽。近年来，激光诱导荧光检测器在痕量和超痕量分析中得到广泛应用，其采用单色性和聚光性能好的激光被作为荧光检测器的光源，利用激光作为相干光源具有较高的光子流量的特征极大地增强了荧光检测的信噪比，因而具有很高的灵敏度。

4.电化学检测器

电化学检测器（electrochemical detector，ECD）是根据电化学原理和物质的电化学性质进行检测的。在液相色谱中对那些没有紫外吸收或不能发出荧光但具有电化学活性的物质，可采用电化学检测法。若在分离柱后采用衍生技术，还可将它扩展到非电化学活性物质的检测。早在1952年波兰科学家Wiktor Kemula就将极谱技术用于液相色谱的检测，但那时该技术发展缓慢。后来，对哺乳动物中枢神经系统代谢物的研究刺激了液相色谱电化学检测器的现代发展。自从1974年第一台商品化的液相色谱电化学检测器出现后，一系列其他领域的应用逐渐发展。目前液相色谱电化学检测器已在生化、医学、食品、环境分析等领域获得广泛的应用。虽然按应用数量而言，电化学检测器排在紫外吸收、荧光和示差折光检测器之后占第四位，但是由于电化学检测器的高选择性、高灵敏度和低造价等优点，在液相色谱检测中发挥着不可替代的作用。

电化学检测器主要有安培、极谱、库仑和电导检测器四种。前三种统称为伏安检测器，以测量电解电流的大小为基础，后者则以测量液体的电阻变化为依据。其中，以安培检测器的应用最为广泛。此外，属于电化学检测器的，还有依据测量流出物电容量变化的电容检测器，依据测量电池电动势大小的电位检测器。另外，按照测量参数的不同，电化学检测器又可分为两类，即：测量溶液整体性质的检测器，包括电导检测器和电容检测器；以及测量溶质组分性质的检测器，包括安培、极谱、库仑和电位检测器。一般来说，前者通用性强，而后者具有较高的灵敏度和选择性。目前，电化学检测器已在各种无机和有机阴阳离子、生物组织和体液的代谢物、食品添加剂、环境污染物、生化制品、农药及医药等的测定中获得了广泛的应用。其中，电导检测器在离子色谱中应用最多。

电化学检测器的优点如下：

① 灵敏度高，最小检测量一般为ng级，有的可达pg级；

② 选择性好，可测定大量非电化学活性物质中极痕量的电化学活性物质；

③ 线性范围宽，一般为4～5个数量级；

④ 设备简单，成本较低；

⑤ 易于自动操作。

5.化学发光检测器

化学发光检测器（chemiluminescence detector，CLD）是近年来发展起来的一种快速、灵敏的新型检测器，因其设备简单、价廉、线性范围宽等优点。其原理是基于某些物质在常温下进行化学反应，生成处于激发态势反应中间体或反应产物，当它们从激发态返回基态时，就发射出光子。由于物质激发态的能量是来自化学反应，故叫作化学发光。当分离组分从色谱柱中洗脱出来后，立即与适当的化学发光试剂混合，引起化学反应，导致发光物质产生辐射，其光强度与该物质的浓度成正比。

这种检测器不需要光源，也不需要复杂的光学系统，只要有恒流泵，将化学发光试剂以一定的流速泵入混合器中，使之与柱流出物迅速而又均匀地混合产生化学发光，通过光电倍增管将光信号变成电信号，就可进行检测。这种检测器的最小检出量可达10～12g。CLD与其他检测器相比，有以下优点：①因它背景光十分弱，是暗背景发光，所以灵敏度高；②它仅对被测组分有响应，其他组分无响应，所以选择性好；③样品可直接分析，使分析方法简化，特别是可省去复杂、费时的样品前处理。CLD的缺点是：①价格较高；②使用的反应气或化学发光反应产物经常是危险性的气体。

6.蒸发光散射检测器

20世纪90年代出现的蒸发光散射检测器（evaporative light-scattering detector，ELSD）是一种通用型检测器，能检测不含发色团的化合物，如：碳水化合物、脂类、聚合物、未衍生脂肪酸和氨基酸、表面活性剂、药物（人参皂苷、黄芪甲苷），并在没有标准品和化合物结构参数未知的情况下检测未知化合物。

ELSD的原理为在粒子数量不变的条件下，光散射强度正比于由溶质浓度决定的粒子大小。ELSD检测主要包括三个步骤：首先用惰性气体将柱洗脱液雾化形成气溶胶，然后在加热的漂移管中将溶剂蒸发，最后余下的不挥发性溶质颗粒在光散射检测池中得到检测。

ELSD一般都是由三部分组成，即雾化器、加热漂移管和光散射池。雾化器与分析柱出口直接相连，柱洗脱液进入雾化器针管，在针的末端，洗脱液和充入的气体（通常为氮气）混合形成均匀的微小液滴，可通过调节气体和流动相的流速来调节雾化器产生的液滴大小。漂移管的作用在于使气溶胶中的易挥发组分挥发，流动相中的不挥发成分经过漂移管进入光散射池。在光散池中，样品颗粒散射光源发出的光经检测器检测产生光电信号。

影响蒸发光散射检测器的因素有如下几点：

（1）漂移管温度的影响　随温度升高，流动相蒸发趋向完全，信噪比升高，但温度过高可能导致组分部分化而使信号变小。最优温度应是在流动相基本蒸发的基础上，产生可接受噪声的最低温度。

（2）载气流速对响应值的影响　随气体流速的增大，响应值随之减小。因为一般漂移粒子的数目基本不变，大小由气体流速决定，流速大，粒子小，散射光弱，响应值小。最优气体流速应是在可接受噪声的基础上，产生最大响应的最低气体流速。提高管温和降低流速可使信噪比上升，但温度过高或流速过低，噪声增大的趋势大于响应值增大的趋势，致信噪比下降。

（3）盐对基线噪声的影响　对高浓度的盐，盐的不完全挥发会造成基线升高，使样品响应值受气体流速的影响相对变小；对低浓度的盐，盐较容易完全挥发使响应值受其影响较大。对用作缓冲体系的盐既要容易挥发，又要具有好的纯度，一般盐的挥发性越大，所需的气体流速和漂移管温度越低。

与其他检测器相比，ELSD的响应不依赖样品的光学特性，任何挥发性低于流动相的样品均能被检测，不受其官能团的影响；作为通用型检测器，ELSD的灵敏度比示差折光检测器高，对温度变化不敏感，基线稳定，适合与梯度洗脱液相色谱联用。但是，ELSD不适合测定可挥发和半挥发性化合物，并且流动相必须是可挥发的，如果流动相含有缓冲液，则必须使用挥发性盐如醋酸铵等，而且浓度要尽可能低。

（五）数据处理系统

该系统可对测试数据进行采集、存储、显示、打印和处理等操作，使样品的分离、制备或鉴定工作能正确开展。随着计算机的普及，HPLC的数据处理主要由计算机及相应的色谱工作站完成。

目前，不同HPLC仪器厂家均研发了各自不同的色谱工作站，虽然界面和操作相差极大，但主要的功能模式是类似的，大致包括状态诊断、操作控制、数据谱图处理等。

（1）状态诊断　对HPLC的整体运行进行监控，并以模拟图形的方式显示诊断结果，协助使用者及时判断仪器的故障并采取相应的措施。

（2）操作控制　所有参数的控制均由色谱工作站的图形操作界面完成，使用者可以在工作站设定或更改诸如流动相流量、梯度洗脱程序、柱温箱温度、检测器灵敏度、激发波长、吸收波长等参数，并具备大量样品序列运行控制及序列完成后的自动关机操作等功能。

（3）数据谱图处理　可对检测结果作在线实时分析或离线统计处理。可以清晰显示色谱流出曲线，自动标注保留时间，按一定原则计算峰面积、峰高和半峰宽，集成有归一化法、内标法和外标法等经典的统计数据处理模块。而且可以按照应用的需要对谱图进行放大、缩小、合并峰、叠加多重峰的操作，柱效、分离度、拖尾因子和工作曲线的计算均可在使用者的规范下自动完成。