四、影响细胞核内DNA含量测定的因素

影响细胞核内DNA含量测定的因素很多，大概可为标本因素和系统因素。

（一）标本因素

标本的取材、制片及染色等因素都可影响细胞内DNA含量的测定。

1．固定、酸化、染色：细胞核内的DNA可因固定不好而脱落，引起DNA含量减少；标本在Feulgen染色时，酸化很重要，如果酸化不好，核酸就不能变为含醛基的脱氧核糖核酸，DNA分子就不易与Schiff's试制结合而影响IOD；Schiff's试制染色过程中的浓度、时间和pH值均可影响细胞核测定的IOD值（见第三章Feulgen染色）。

2．CV（coefficient of variance）：在同种组织中细胞之间的DNA含量也存在着一些差别。这种差别一般＜2%。同种组织细胞DNA含量测定时的差别用CV来表示。

不同组织细胞CV是不同的，但这种差别多在10%以下。如果CV在10%以下，这时DNA-ICM就可测定到同种细胞内多于10%DNA含量的变化，如DNA增多。当CV为10%时，G0/G1细胞（二倍体细胞）DNA含量应在2c±0.2c（DI 1±0.1）之内，G2/M细胞（四倍体细胞）DNA含量应在4c±0.4c（DI 2± 0.2）之内。ESACP（European Society of Analytical Cellular Pathology）要求DNA-ICM的CV应小于5%，这样就可更精确的测定DNA含量。

（二）DNA-ICM系统因素

1．噪声（Noise）：信噪比是指在有效输出范围内，真值信号强度和噪声强度的比值。噪声的大小是衡量数码相机成像质量的重要指标。数码相机的噪声，主要是指传感器在捕捉、放大以及处理光信号的过程中，所产生的粗糙部分。噪声等级则取决于数码相机的信噪比。

2．Γ值（Gamma）：它是衡量数码相机输出信号和光强之间关系（以对数单位为刻度的直线的斜率）接近程度的量，其理论值为1。

3．杂散光（Glare）：由光学系统表面的光线反射引起，并作用于显微镜的视野。

4．阴影（Shading）：所谓阴影是人眼看来是均匀的视场内存在着不均匀的电子反应，这使得灰度相同的图像成分由于在视场中所处位置不同而显示出不同的灰度。其来源包括图像源的不均匀光照、穿过透镜时光路发生变化引起的透镜阴影以及显像管本身的图像灵敏度差异引起的扫描阴影。运用合适的算法可以修正阴影。

5．聚焦（Focus）：即使单层细胞在玻片上，并不是每个细胞都在一个平面上，如有些细胞有些倾斜等。因此，要确切的测定细胞核，就必须对每一个被测细胞核聚焦。为此，测定到细胞核，将其被聚焦的细胞核进行小块分割，测定每个小块的光密度（optical density）。一般说来，计算机将被聚焦的细胞数据保存下来，而不能聚焦的细胞不被计算机记录下来。

6．细胞核的边缘分割（Segmentation）：细胞分割，尤其是核边缘的划分和光密度测定可影响整个细胞核的IOD值。

7．相机成像系统（Camera）：一般录相机所用的CCD技术由于像素面积较大，只能测定被测物质30%～40%的面积，而60%～70%面积不能被测到。而改进的CCD相机在20 ×物镜下的像素为0.1μm2（0.34μm ×0.34μm）。这样就可更清晰地测定到细胞核内的内容。