1.2　益生芽孢杆菌概述

1.2.1　芽孢杆菌的简介

芽孢杆菌是普遍存在的一种好氧的、产芽孢的杆状细菌，为革兰氏染色阳性，在《伯杰细菌鉴定手册》第八版中被列入第十五部分“芽孢杆菌和球菌”的芽孢杆菌科（Bacillaceae）的芽孢杆菌属（Bacillus）。芽孢杆菌属细菌是一类好氧或兼性厌氧、产生抗逆性内生孢子的杆状细菌，这类细菌多数为腐生菌，主要分布于土壤、植物体表面及水体中，由于其产生的芽孢能够产生对热、紫外线、电磁辐射和某些化学药品很强的抗性，因此能耐受多种不良环境。芽孢是休眠体不是繁殖体，尽管多数菌体仅形成一个芽孢。芽孢位于菌体内，由核心、皮层、芽孢壳和外壁组成。核心是芽孢的原生质体，内含DNA、RNA、可能与DNA相联系的特异芽孢蛋白质以及合成蛋白质和产生能量的系统。此外，还有大量的吡啶二羧酸钙布满整个芽孢。皮层位于核心和芽孢壳之间，含有丰富的肽聚糖。芽孢壳主要由蛋白质组成，此外，还有少量的碳水化合物和类脂类，可能还有大量的磷。最外层是外壁，主要成分是蛋白质、葡萄糖和类脂。

益生芽孢杆菌在制剂中以内生孢子的形式存在，孢子进入肠道后，在肠道上部能迅速复活并分泌活性很强的蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶，有助于降解植物性饲料中某些复杂的碳水化合物，拮抗肠道内的氧气，造成厌氧环境。肠道原籍上风菌大多属厌氧菌，而有害菌和外来菌多为需氧菌，从而有利于维持肠道生态平衡。该类菌无毒性，能分泌出活性强的蛋白酶等多种酶类，在其生命过程中又能以孢子体形式存在，具有耐高温、耐盐碱、耐挤压、饲料加工对其损伤小等特征，易于生产和保存，作为饲料微生态添加剂和水体微生态调控剂都有广阔远景。

当前益生芽孢杆菌制成的产品有促菌生（蜡样芽孢杆菌）、整肠生（地衣芽孢杆菌）、抑菌生（枯草芽孢杆菌）、乳康生（含蜡样芽孢杆菌）、促康生（需氧芽孢杆菌）。

1.2.2　芽孢杆菌种类

芽孢杆菌属中的各种菌种在适宜温度、所需营养成分、构成、代谢等方面有较大的差异。芽孢杆菌属中有一百多个种，主要包括地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、短芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、环状芽孢杆菌等，其中益生芽孢杆菌主要包括地衣芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌和需氧芽孢杆菌。比如地衣芽孢杆菌，英文名PWD-1（Bacillus licheniformis PWD-1），是一种（0.6～0.8）μm×（1.5～3.0）μm的菌体，芽孢为椭球状或柱状，孢子只是轻微膨大或不膨大，中生或偏中生。地衣芽孢杆菌可以产生许多种小分子的活性物质诸如抗菌蛋白、溶菌酶、细菌素、抗生素等，对多种病原微生物具有良好的抑制作用，被广泛应用于医药、农药、环境治理等各个领域。

芽孢杆菌传统的分类方法主要是根据其形态学特征，即对菌体的形态、大小、芽孢染色情况、荚膜染色、鞭毛染色、革兰氏染色等进行观察并分类。现在大多采用各种分类方法，如生理生化、形态、化学（脂肪酸分析）、分子（DNA碱基分析、同源性分析16S rRNA测序）等方法相结合的多相分类法，是多方面数据的综合分析聚类。在芽孢杆菌属中，种的划分大体是依据芽孢的形态、菌体的大小和在菌体内的部位、对HNO3的还原能力差异、对糖的利用和产物类型以及对高浓度盐的耐受性差异为依据的。芽孢杆菌属中各菌种在生理生化上存在较大差异，部分芽孢杆菌及其生理特征如表1-4所示。

1.2.3　益生芽孢杆菌的特性

（1）益生芽孢杆菌的抗逆性

芽孢是芽孢杆菌特有的结构，其主要特点是抗性强，对高温、紫外线、干燥、辐射等有毒化学物质有较强的抵抗力。由于芽孢具有厚而含水量低的多层结构，所以折光性强、对染料不易着色。在孢子状态下稳定性好，耐氧化、耐挤压、耐高温，如枯草芽孢杆菌一般在95℃下存放5min，89％能保持存活；耐酸碱，在酸性胃环境中能保持活性，可以耐唾液和胆汁的攻击，加工制粒后，95％的芽孢杆菌在水产动物体内可以变成营养体。

（2）益生芽孢杆菌的营养特性

产生多种消化酶：这是其促进水产动物生长性能的一个重要因素。芽孢杆菌在生长繁殖过程中还能产生植酸酶，促使动物对植酸酶的利用和脂肪的消化吸收；产生的氨基氧化酶及分解硫化氢的酶类，可将吲哚类氧化成无毒、无害的物质，从而降低养殖环境中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等有毒有害物质的浓度，创造优质的养殖环境。

产生多种营养物质：芽孢杆菌能合成多种维生素，如尼克酸、叶酸、烟酸，维生素B1、维生素B2、维生素B12等，促进机体对蛋白质的消化、吸收。凝聚芽孢杆菌、芽孢乳杆菌等菌株能产生乳酸，可促进动物对钙、磷、铁的利用，促进维生素D的吸收。此外，芽孢杆菌在生长过程中能产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，这些酸类能够降低动物肠道的pH值，有效抑制病原菌的生长，为乳酸菌的生长创造条件。其中，丙酸还能参与三羧酸循环，为动物新陈代谢提供能量。

增强水产动物免疫性能：芽孢杆菌能通过产生抗体和进一步噬菌作用等刺激免疫，激发体液免疫和细胞免疫，使动物免疫活性增强。

1.2.4　益生芽孢杆菌的作用

（1）拮抗致病微生物

大量的研究表明，益生芽孢杆菌具有拮抗肠道病原细菌、维持和调节肠道微生态平衡的作用。

（2）改善体内外生态环境

饲喂益生芽孢杆菌后，能明显降低肠道大肠杆菌、产气荚膜梭菌、沙门氏菌的数目，使机体内的益生菌增加而潜伏的致病菌减少，因而排泄物、分泌物中的益生菌数目增多，致病性微生物减少，从而净化了体内外环境，减少疾病的发生。

（3）增强动物体的免疫功能

益生芽孢杆菌能通过产生抗体和进入噬菌作用等刺激免疫，激发体液免疫和细胞免疫，使动物免疫活性增强。有资料表明益生芽孢杆菌可使动物血清中的中性粒细胞吞噬率提高17％。

（4）产生多种消化酶

益生芽孢杆菌能促进动物生长性能，是其产生多种消化酶的一个重要性能方面的体现。Collington报道枯草芽孢杆菌具有较强的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、糖化酶活性。同时还具有降解饲料中复杂碳水化合物的酶，如降解果胶、葡聚糖、纤维素等酶，其中是很多动物本身不具有的酶。

（5）产生多种营养物质

凝结芽孢杆菌、芽孢乳杆菌等益生菌菌株能产生乳酸，能够促进动物和人对钙、磷、铁的利用，促进维生素D的吸收。纳豆芽孢杆菌不仅可以分解蛋白质、碳水化合物、脂肪等大分子物质，使发酵产品中富含氨基酸、有机酸、寡糖等多种易被吸收的成分，而且在纳豆芽孢杆菌发酵的纳豆中还发现一些生理活性物质，使其具有多种保健功能。

1.2.5　益生芽孢杆菌产生抑菌物质的种类

益生芽孢杆菌可产生肽类、多烯类、脂肽类、氨基酸类、磷脂类、类噬菌体颗粒、核酸类细菌素等多种抑菌物质。其中如非核糖体途径合成的脂肽类抗生素表面活性素（surfactin）、伊枯草菌素（iturin）和丰素（fengycin）；核糖体途径合成的肽类抗生素枯草菌素（subtilin）、sublancin等，这些抗生素可克服病原菌对现有的抗菌素的抗性问题。

抗菌肽生物活性高、抗菌谱广且不易引起耐药性，具有水溶性强、强碱性、分子量低、热稳定性好等特点。Naclerio等从食物中分离得到的蜡样芽孢杆菌内分离提取得到一种抗菌肽，称为蜡样素（cerein）。该蜡样素在很宽的pH值范围内能够保持其生物学活性，且具有一定的热稳定性。用胰岛素、蛋白酶或胰凝乳蛋白酶处理，则很快完全失去活性，而用RNaseA、溶菌酶、DNase和一些有机溶剂则不能使其失活。mersacidin、subtilin、sublancin都属于抗菌肽，三者的相对分子质量分别为：1825，3317和3877。研究发现，Bacillus subtilis 168产生的tasA，subtilosin，sublancin等核糖体抗生素，也属于抗菌肽。并且mersacidin、subtilin、sublancin、tasA、subtilosin、sublancin这些抗菌肽的分子结构已经被测定出。

蛋白质类抑菌物质包括抗菌蛋白、几丁质酶、多肽类。Bacillus licheniformis、Bacillus brevis、Bacillus subtilis G3都可以产生几丁质酶，几丁质酶是一种分解N-乙酰氨基葡萄糖分子的糖苷酶。Bacillus subtilis分泌的抗菌物质主要是抗菌蛋白，目前已见报道的有：Bacillus subtilis A014，Bacillus subtilis A30，Bacillus subtilis B34，Bacillus subtilis B034，Bacillus subtilis B-916等菌株。Bacillus thuringiensis对苜蓿种子病害具有良好的抑制效果，经研究表明是其产生的zwittermicin A发挥的作用。Bacillus cereus UW85菌系可以产生两种抑菌物质，其中一种是属于zwittermicin的氨基多肽。

Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）分泌的主要抗菌物质为脂肽类抑菌物质。脂肽类物质有非磷脂类抗生素bacilysocin、核糖体抗生素bacolysin、抗菌枯草素、surfactin和iturin等。Leiffert等报道的Bacillus brevis（短芽孢杆菌）CL45和Bacillus subtilis（枯草芽孢杆菌）CL27也可以产生脂肽类抑菌物质。据报道，Bacillus amyloquefaciens（解淀粉芽孢杆菌）和Bacillus subtilis G3（枯草芽孢杆菌）都可以抑菌物质iturin A（伊枯草菌素）。

1.2.6　益生芽孢杆菌的应用优势

相对于乳酸菌和酵母菌而言，益生芽孢杆菌具有其独特的应用优势，主要体现在以下4个方面。

（1）应用的安全性

一些芽孢杆菌已经被“公认安全（GRAS）”在食品和饲料中可以放心使用。而且科学家对人用和饲料用的芽孢杆菌的安全性做了专门研究，也未发现常用的益生芽孢杆菌存在潜在安全危害性。而且，芽孢杆菌代谢产生的多种酶，如淀粉酶、蛋白酶在食品及饲料中广泛应用，目前尚未发现有任何副作用。因此，芽孢杆菌作为微生态制剂对动物生长无毒无害，生产出的动物性食品同样也是安全的，这是饲用芽孢杆菌在饲料中广泛应用的前提条件。

（2）广谱的抗菌活性

益生芽孢杆菌最可能的作用机理之一就是它的抗菌活性，益生芽孢杆菌在生长代谢过程中能够产生一些细菌素类的物质，对一些病原微生物具有很好的抑制作用，如B. subtilis 3被用来治疗幽门螺杆菌引起的胃溃疡，B. subtilis MA139能显著抑制大肠杆菌K88和鼠伤寒沙门氏菌的增殖。因此，芽孢杆菌对于饲料贮存中防止细菌或霉菌污染，动物饲养过程中避免革兰氏阴性病原菌如E.coli K88+和Salmonella等细菌对肠道感染有一定的预防作用。

（3）代谢快，稳定性高

相对于其他类型益生菌，益生芽孢杆菌一般对营养要求简单，代谢速度快，而且易于分离、培养和保存，对于工业化生产的要求不高。此外，益生芽孢杆菌本身能产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学药品有很强抗性的芽孢，可以忍受不良环境，如可以在pH值为2～3的地方生存，也可以在温度高达80℃甚至更高的环境中生长。因此，益生芽孢杆菌作为益生菌易于保存，使用方便，活性成分高，从而大大提升了芽孢杆菌的推广和应用价值。

（4）分子加工易操作性

现在，益生芽孢杆菌的分子生物学研究已很深入，关于其生理和遗传特性的研究仅次于大肠杆菌，现有的分子生物学工具和知识在控制和使用芽孢杆菌上显示出很大的优势。利用分子生物学的手段可以研发高产性能的菌种，提高微生态制剂的饲喂效果，如把蛋白酶、木聚糖酶的基因转移到芽孢杆菌中进行表达等，可以更大程度上发挥芽孢杆菌益生素的作用效果。

1.2.7　益生芽孢杆菌的作用机理

（1）免疫调节

益生菌一个很重要的作用机制就是能够刺激作用机体的免疫系统或进行免疫调节。益生菌制剂经口服摄入后有部分芽孢能够进入到肠系膜淋巴结的淋巴组织中，能促进抗芽孢的IgG和分泌型的IgA（sIgA）显著升高。益生芽孢杆菌能促进动物肠道相关淋巴组织处于高度的“免疫准备状态”，同时使免疫器官发育加快，免疫系统成熟快而早，T、B淋巴细胞数量增多，提高动物体液和细胞免疫水平。Inooka等研究结果表明，以107 CFU/g剂量的枯草芽孢杆菌饲喂雏鸡时，显著提高了脾脏中T、B淋巴细胞数量，但是对脾脏中巨噬细胞的活性没有影响。Kosaka等用B.subtilis A102的芽孢饲喂小鼠，1d后发现血清中干扰素水平增加了5倍，同时也显著增加了小鼠自然杀伤细胞（natural killer cells）和巨噬细胞活性。芽孢杆菌的芽孢免疫刺激活性可能与菌体的细胞壁成分有关。Himanen等研究枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸和肽聚糖-磷壁酸复合物的生物活性证明两者均具有免疫佐剂活性作用，在Kosaka等的研究证实，B.subtilis A102的死细胞和活细胞菌体对小鼠的免疫刺激活性效果一致。

（2）对病原菌的拮抗活性

益生芽孢杆菌现已大量用作药物、保健食品、饲料添加剂。国内外的普遍观点认为，益生芽孢杆菌在胃肠道代谢产生一些肽类等的抗菌物质来抑制病原菌被认为是其发挥“益生”效果的一条重要机制。这些物质既包括细菌素类的物质，如subtilin和coagulin，也有一些抗生素类的物质，如surfactin、iturin A和bacilysin等。如在医药中，Bacillus subtilis 3被用来治疗幽门螺杆菌引起的胃溃疡；益生芽孢杆菌产品Bioplus 2B对家禽和猪的生长及健康具有良好的促进作用；Toyocerin能很好的控制断奶仔猪的腹泻；益生芽孢杆菌类添加剂如biostart及liqualife用于提高水产动物（尤其是虾类）对病原菌的抵御能力。