2.3　蜡样芽孢杆菌的鉴定

2.3.1　蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别实验

（1）动力实验

将培养物穿刺接种于动力培养基中，30℃条件下培养24h。观察菌株生长情况，若菌株沿穿刺线呈扩散生长，则为有动力蜡样芽孢杆菌；若菌株呈绒毛状生长，形成所谓的蜂巢状扩散，则为蕈状芽孢杆菌。还可通过悬滴法进行检测。通常，蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌运动极为活泼，而炭疽芽孢杆菌不运动。

（2）根状生长实验

用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上，30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡样的菌落。其中只有蕈状芽孢杆菌形成根状生长的特征。

（3）溶血实验

取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上，30～32℃培养24h。蜡样芽孢杆菌周围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象，而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。

（4）蛋白结晶毒素实验

滴加营养琼脂培养物（30℃条件下培养24h并于室温放置2～3d）少许于载玻片上，用蒸馏水混涂成薄膜。依次经自然干燥，微火固定后，于涂膜处滴加甲醇30s后倾掉，再通过火焰进行干燥，将滴满0.5％碱性复红液的载玻片放火焰上加热，微见蒸气（勿使染液沸腾）后持续1.5min，移去火焰，载玻片放置0.5min后倾去染液。用蒸馏水彻底清洗、晾干后镜检，观察是否存在游离芽孢以及染成黑色的菱形毒素结晶体。若观察到游离芽孢的形成不丰富，则将培养物置于室温条件下2～3d后再进行镜检。用此法检验，苏云金芽孢杆菌呈阳性，蜡样芽孢杆菌群的其他菌种呈阴性。

（5）结果解释及报告

符合蜡样芽孢杆菌群的特征，有活泼的动力，很强的溶血能力，不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素，可报告为蜡样芽孢杆菌。

对偶尔的一些少数可疑菌株，可以根据需要进行其他实验，如青霉素酶、噬菌体实验等。

2.3.2　国际法检验蜡样芽孢杆菌

芽孢杆菌的竞争力强，有些芽孢杆菌产生抗生素，甘露醇卵黄多黏菌素平板上生长的菌落为芽孢杆菌属等革兰氏阳性菌。ISO标准（7932—2004）也采用了此培养基作为蜡样芽孢杆菌的选择性平板。

（1）国标法（GB 4789.14—2003）蜡样芽孢杆菌的检验程序（图2-5）

（2）甘露醇卵黄多黏菌素琼脂培养基（MYP）的制备

①基础琼脂：牛肉膏1.0g，蛋白胨10.0g，D-甘露醇10.0g，氯化钠10.0g，琼脂15.0g，酚红0.025g（配成溶液加入），蒸馏水900mL。

②50％卵黄液50mL。

③多黏菌素B 100IU/mL。

将①中的前5种成分加入蒸馏水中加热溶解，校正pH值至7.2±0.1，加入酚红溶液，混匀后分装烧瓶中，每瓶225mL。121℃高压灭菌15min。用时加热溶化，冷至50℃后每瓶加入50％卵黄液12.5mL和2.5mL多黏菌素B溶液，混匀后倾注灭菌平皿，每皿15～18mL。用前应将平板置室温约24h。

注：①50％卵黄液：取鲜鸡蛋，用硬刷将蛋壳彻底洗净，沥干，放于70％酒精溶液中浸泡1h，以无菌操作取出卵黄，加入等量灭菌生理盐水，混匀后备用。

②多黏菌素B溶液：在50mL灭菌蒸馏水中溶解500000国际单位的无菌硫酸盐多黏菌素B。

（3）该检验方法原理

在MYP培养基中，蜡样芽孢杆菌的生长会导致pH值不同程度的下降，以及菌落、培养基、脂肪晕变黄的过程，这是由蜡样芽孢杆菌产卵磷脂酶C引起的。磷脂酶分为A1、A2、C、D四类，分别与磷脂的不同酯键作用，所得产物不尽相同。卵磷脂酶C作用于卵磷脂的磷酸酯键产生甘油二酯和磷酸胆碱，其中磷酸胆碱在培养基中以离子的形式存在，与此同时，磷酯酶A1、A2水解卵磷脂产生的脂肪酸使总体呈酸性。在相同培养时间内，不同浓度培养物的单位面积中，pH值变化差异显著。菌液浓度愈大，则产酸愈多且变黄时间愈早；反之，则产酸少而变黄时间晚。继续培养产生的变化则与蜡样芽孢杆菌产生的卵磷脂酶C无关，即pH值逐渐恢复并上升至8.5，培养基及脂肪晕由黄变红并加深。

有人实验，即使在106个细菌中各有一个蜡样芽孢杆菌，用MYP也能够检出。在甘露醇卵黄多黏菌素平板上，只要粉红色大菌落且卵黄反应阳性时基本就能判断为蜡样芽孢杆菌。即使样品中杂菌多时，也很容易被检出，如图2-6所示，生成的菌落为粉红色，环绕产生卵磷脂酶沉淀环。

甘露醇卵黄多黏菌素平板的缺陷为：无缓冲能力，非蜡样芽孢杆菌产生的酸容易遍及整个平板，使菌落皆不能显粉红色，难以区分发酵甘露醇的菌落和不发酵甘露醇的菌落。实际操作时要注意选择3～30的菌落计数。另外该培养基对受伤的蜡样芽孢杆菌有微弱伤害。

在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂平板上挑出粉红色、周围有浑浊带的菌落，以动力、卵磷脂酶+、酪蛋白酶+、触酶+、溶血、甘露醇–、木糖+、厌氧利用葡萄糖、明胶液化大多数+、大多数还原硝酸盐来确认。

在甘露醇卵黄多黏菌素琼脂平板上挑出粉红色菌落后，也有通过触酶实验阳性、VP反应阳性、厌氧生长、pH 5.7生长、50℃生长、利用葡萄糖产气来确认的，只要前四项完全符合就可以准确判定为蜡样芽孢杆菌。

在检验中容易混淆的芽孢杆菌如下。蕈状芽孢杆菌：琼脂平板上开成根毛状菌落，没有运动性，在平板上容易与其他菌区分；炭疽芽孢杆菌：产生荚膜，在有青霉素的培养基上不生长；苏云金芽孢杆菌：产生伴胞晶体。

2.3.3　DNA重组实验鉴定

DNA重组实验在蜡样芽孢杆菌的分型上是非常有意义的。蜡样芽孢杆菌与近缘菌DNA重结合，有很高的结合率（表2-1）。蜡样芽孢杆菌与苏云金芽孢杆菌可结合53％～80％，与蕈状芽孢杆菌可结合80％，与炭疽芽孢杆菌菌株st可结合56％，与炭疽芽孢杆菌菌株A3可结合94％。由此可证明蜡样芽孢杆菌与上述近缘菌之间的同源性。但只有同型菌才能达到DNA 100％结合（表2-1）。若选出蜡样芽孢杆菌各型的标准株，用于鉴定分型，对于蜡样芽孢杆菌的分型将具有重大意义。

注：表中数字为结合百分率，“—”为无资料。

2.3.4　噬菌体实验

通过蜡样噬菌体特异性地裂解蜡样芽孢杆菌鉴定菌种已成为一种常用菌种鉴定方法。大量实验（平板裂解实验）发现，常用蜡样噬菌体能裂解绝大多数蜡样芽孢杆菌，仅使个别菌株菌苔变薄，成微小噬斑；通常情况下，若不能被蜡样噬菌体裂解则不是蜡样芽孢杆菌，其他需氧芽孢杆菌绝大多数不能被其裂解。目前，具有很高特异性的蜡样噬菌体裂解实验已成为菌种鉴定时不可或缺的手段。

噬菌体作用于细菌的过程为噬菌体吸附于菌体并注入其DNA，噬菌体DNA在菌体内复制并指导蛋白质的合成，两者装配后，裂解菌体而释放出噬菌体。其中决定噬菌体特异性及其活动的先决条件为吸附作用。菌内裂解是指少数几个噬菌体侵袭一个细菌，在菌体内复制生成千百个噬菌体的过程，这是噬菌体增殖所希望的。菌外裂解是指很多噬菌体侵袭一个细菌，千疮百孔的细菌来不及复制DNA即死亡，此时噬菌体总数会减少。

噬菌体的增殖通常有两种方法，即肉汤法和软琼脂法。通常情况下，肉汤法效价可达107～108个/mL噬斑，但由于噬菌体用量比例太高而造成的菌外裂解使效价不易增高；软琼脂法效价可达1011个/mL噬斑，但要求在噬菌体和细菌量的合适比例下增殖，该合适比例是指软琼脂板上噬斑大多融合仅有个别残留菌的比例，比例合适时，大多为菌内裂解，其效价较高。

为了使实验时间缩短，过祥豹在技术上进行改进，创建噬菌体快速裂解法。于1/4普通琼脂平板上接种待测菌株，用L形玻棒均匀充分涂布后于中心滴加一滴高效价（1011个/mL噬斑）噬菌体，37℃条件下培养5h后，用肉眼观察最终结果，由于噬菌体效价高，裂解作用强（吸附作用决定其特异性，因此菌外裂解在菌种鉴定中无影响），细菌接种量大，生长快，因此与24h常规法比较发现结果完全一致。用L玻棒涂布能使平板表面保持光滑如镜，从而使噬菌体裂解透明区与细菌呈毛玻璃样生长区形成极为明显的对比，利于早期结果的观察。

2.3.5　分子鉴定

生物细胞DNA分子的一级结构中同时存在保守的片段和变化的碱基序列。其中保守片段反映的是生物物种间的亲缘关系，高变片段反映的是物种间的差异。这些保守的或高变的特征性核苷酸序列可作为分子基础鉴定生物的不同分类级别（如科、属、种），因此可根据rDNA（核糖体DNA）序列设计一种探针，用于检测或鉴定某一种、属、科甚至更大类群范围的生物。细菌中rRNA高度保守，以16S rRNA为PCR扩增靶分子，现已成功建立细菌快速分类鉴定的标准方法，可应用该方法进行细菌种、属和科的鉴定以及系统进化分析等。这项工作为微生物的遗传背景、代谢途径、菌株间亲缘关系的研究奠定了基础。

16S rRNA基因核苷酸序列具有总长度适宜及结构完整的特点，有利于对细菌进行各种研究。以16S rRNA为靶分子，设计一对引物，适当条件下进行PCR扩增从而得到扩增后的16S rRNA片段，用化学降解法或链终止法对片段进行测序，测序完成后，将得到的序列在NCBI上进行BLAST程序比对，选取十株具有代表性的菌株，将该序列通过BLAST程序与GenBank中的核酸数据进行对比分析，利用Clustal X（Version1.8）和MEGA2.0软件进行多序列比对及系统发育树构建，明确菌株的分类地位。如图2-7中Bacillus cereus CGMCC4348与Bacillus cereus strain 5YW6的同源性达到99％。当鉴定具有很高同源性的菌种时，16S rRNA序列分析法在分类学中具有不可替代的地位，生理生化实验或其他方法可作为补充。

2.3.6　蜡样芽孢杆菌生化特性及其检验方法

蜡样芽孢杆菌在进行芽孢杆菌的属、种（型）间鉴定时，生化特性是其重要的指标。因此，了解和掌握芽孢杆菌的一些主要的生化特性及其检查方法，对准确鉴定蜡样芽孢杆菌非常重要。

菌株的主要生理生化特征见表2-2。

注：“+”生长或者利用；“–”不生长或者不利用。

蜡样芽孢杆菌在其发酵过程中，不仅要消耗大量的营养物质，而且能够产生大量的代谢产物，这些代谢产物的种类相当复杂。不同的微生物所产生的代谢产物成分也是不尽相同。研究人员主要通过对好氧能力、运动性、嗜碱或嗜盐性和产酶能力等方面来鉴定蜡样芽孢杆菌各种生化性能特征。蜡样芽孢杆菌常用生理生化特性鉴定方法分述如下。

（1）葡萄糖的氧化发酵实验

先将菌株培养18～24h，再穿刺接种于休和利夫森二氏培养基（蛋白胨2～5g、NaCl 5g、K2HPO40.2～2g、葡萄糖10g、琼脂5～6g、1％溴甲酚紫3mL、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2），共转接4管，其中两管用灭菌的凡士林石蜡油封盖，厚度0.5～1cm，以隔绝空气，另两管不封盖与闭管作对照。

35℃厌氧培养24h后观察结果，培养基应由红色变为黄色（表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸）。只有开管变黄者为氧化型，开管、闭管均变黄者为发酵型。

（2）需氧性测定

将斜面培养18～24h的菌株穿刺转接到斜面培养基（蛋白胨2g、NaCl 5g、K2HPO42g、琼脂5～6g、葡萄糖10g、蒸馏水1000mL，pH7.2）的管底，3d后进行观察。若菌落沿培养基表面生长则为好氧菌，反应为阳性；若菌落沿穿刺线生长则为厌氧或兼性厌氧菌，反应为阴性。

（3）柠檬酸盐利用实验

配置柠檬酸盐培养基［柠檬酸钠2g、NaCl 5g、MgSO40.2g、K2HPO41g、（NH4）2HPO41g、琼脂20g、1％溴百里酚蓝水溶液10mL为指示剂、蒸馏水1000mL，pH6.8～6.9］，将除指示剂外的成分加热溶解后加入指示剂，使培养基呈草绿色，分装试管灭菌，搁成斜面。划线接种，28℃培养3～7d，培养基呈碱性（指示剂蓝色）者为阳性，否则为阴性。

（4）硝酸盐还原实验

将待测菌株接种于硝酸盐培养基（牛肉膏蛋白胨培养基1L、KNO31g，pH7.0），设两个重复，另留两管不接种作为对照组，28℃培养3d。每支试管中各加入一滴甲液［对氨基苯磺酸0.5g、稀醋酸（10％）150mL］、乙液［α-萘胺0.1g、稀醋酸（10％）150mL、蒸馏水20mL］，观察结果。

当溶液变为红色（包括粉红色、玫瑰红色、橙色、棕色）时表明存在亚硝酸盐，为硝酸盐还原阳性；若无红色出现，则加入1～2滴二苯胺试剂，此时，若呈现蓝色，则硝酸盐为还原阴性，表明培养液中有硝酸盐但无还原作用；若不呈现蓝色，则按阳性处理，表明硝酸盐和形成的亚硝酸盐都已还原成其他物质。

（5）接触酶实验

将菌株接种于LB培固体养基（胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化钠10g/L、琼脂15g/L）上，30℃条件下培养24h后，滴加10％的H2O2，观察是否有气泡产生，产气泡为阳性。

（6）V-P实验

将待测菌株接种于液体培养基（蛋白胨5g、葡萄糖5g、K2HPO45g、NaCl 0.5g、蒸馏水1000mL、pH7.0～7.2）中，35℃条件下培养48h后，取出培养液与40％NaOH等量混合，滴加少量肌酸，剧烈振荡3min，观察培养液颜色。若出现伊红色，则为阳性；若无变化，则为阴性。

（7）酪朊水解实验

将菌株点接于牛奶平板（5g脱脂奶粉和1.5g琼脂分别溶于50mL水中，将两液分开灭菌，冷却至45～50℃时将两液混匀倒平板，倒置过夜，使表面水分充分干燥）上。28℃条件下培养1d、3d、5d，记录菌落下面酪素的分解情况以及菌落周围是否透明，若透明，则为阳性。

（8）淀粉水解实验

将蜡样芽孢杆菌点接于培养基（添加2％的可溶性淀粉于牛肉膏蛋白胨培养基中，倒平板，倒置过夜）上，28℃条件下培养2～5d，观察明显的菌落后，滴加碘液于平板上使平板呈蓝黑色，若菌落周围出现不变色透明圈，说明淀粉水解呈阳性，若无变化则为阴性。

（9）明胶液化实验

菌株培养18～24h后，将其穿刺接种于斜面培养基（蛋白胨5g、明胶100～150g、蒸馏水1000mL，pH7.0～7.2）上，并设置空白对照。于室温培养箱中培养2d、7d、10d、14d、30d，分别观察记录明胶液化情况，若明胶表面无凹陷为稳定的凝块且菌已生长，则为水解阴性；若在20℃下，明胶凝块全部或部分变为可流动液体，则为水解阳性。若明胶未液化但明胶表面菌苔下出现凹陷小窝（须与空白对照比较，因明胶培养过久因水分散失也会有凹陷）且菌已生长，为轻度水解，按阳性记录。

（10）酪氨酸水解实验

添加0.1％酪氨酸于肉汤蛋白胨培养基中，pH值校定为7.0，分装灭菌，排成斜面。将菌株接种于上述培养基中，28℃条件下培养3～7d，观察，斜面产黑色素者为阳性。

（11）甲基红（M.R.）实验

将菌株接种于培养基（蛋白胨0.5g、葡萄糖0.5g K2HPO40.5g、NaCl 0.05g、蒸馏水100mL、pH7.0～7.2）中，每次进行两个重复。30℃条件下培养6d后，滴加一滴甲基红试剂于培养液中，观察培养液颜色变化，培养液呈红色为甲基红阳性，黄色为甲基红阴性。

（12）糖醇类发酵实验

通过直针穿刺将幼龄菌株接种于培养基（酵母膏0.2g、糖或醇类10.0g、KCl 0.2g、NH4H2PO41.0g、MgSO40.2g、琼脂5g、0.04％溴甲酚紫-酒精液20mL、蒸馏水1000mL）上，28℃条件下培养3～5d，观察颜色变化，若指示剂变黄，则为阳性，表明糖醇发酵产酸；若无变化或变蓝（紫），则为阴性。若琼脂柱中出现气泡，则表明产气。

（13）蜡样芽孢杆菌生化特性鉴定标准

对于蜡样芽孢杆菌的生化特性鉴定标准，现采用的鉴定项目中只有80％左右的菌株呈现阳性或阴性，这种相对标准，作为菌株群体鉴定似乎合理，但具体到菌株个体，就有一些项目与标准不符，以至难以判定或误判。因此，董树林建议将生化特性鉴定项目标准分为二级（表2-3）：一级是确诊标准，每个菌株对所列鉴定项目必须完全相符，即以100％阳性或阴性特征作为鉴定菌种的确诊标准。每个菌株有一项与标准不符也不能认定为蜡样芽孢杆菌；二级是参考标准，以90％～99％阳性或阴性特征项目作为参考标准，某个具体菌株可以有部分项目相符，部分项目不符，只要一级标准相符即可确定。故蜡样芽孢杆菌的生化鉴定标准可归纳为表2-3。