第三节 凝乳酶

一、凝乳酶的凝乳原理

干酪加工中添加凝乳酶的主要目的是促使牛乳凝结，为排除乳清提供条件。凝乳酶是干酪制造过程中起凝乳作用的关键性酶，对干酪的质构及其特有风味的形成均非常重要，凝乳酶与酪蛋白的专一性结合使牛乳凝固。凝乳酶对酪蛋白的凝固可分为两个过程：①酪蛋白在凝乳酶的作用下，形成副酪蛋白，称为酶性变化。②产生的副酪蛋白在游离钙的存在下，在副酪蛋白分子间形成“钙桥”，使副酪蛋白的微粒发生团聚作用而产生凝胶体，称为非酶变化。这两个过程的发生使酶凝固和酸凝固不同，酶凝固时，钙和磷酸盐并不从酪蛋白微球中游离出来。在实际操作中，酶凝固的两个阶段有重叠现象，无法明显区分。

二、影响凝乳酶凝乳的因素

影响酶活力的因素包括乳的pH、温度、底物浓度及乳中的钙离子浓度等。

（一）pH的影响

凝乳酶属于酸性蛋白酶，由于酶的活性中心有2个天冬氨酸，这2个天冬氨酸的羟基1个以离子化形式存在、1个以质子化形式存在，又称天冬氨酸蛋白酶。pH通过对凝乳酶活性中心天冬氨酸的解离形式而影响酶的活力，从而影响凝乳反应第一阶段的反应速度。酸性蛋白酶的最适pH在1.5～5.0。干酪生产中，乳的pH越低，凝乳速度越快。小牛皱胃酶是凝乳酶和胃蛋白酶的混合物，胃蛋白酶在pH2.0～5.0、凝乳酶在pH1.5～5.0范围内有较高的活力和稳定性。所以发酵剂使乳的预酸化有利于酶促凝乳的形成。但在干酪生产过程中并不是凝乳越快越好，研究证明，酸度超过27 °T时凝乳速度加快，但凝块切面粗糙；当酸度超过36°T时产生絮状沉淀。所以干酪生产中加入发酵剂后酸度到20°T左右时即加入凝乳酶，可以得到较快的凝乳速度和较好的凝块质地。

（二）温度的影响

温度变化主要影响凝乳反应的第二阶段。凝乳酶水解k-酪蛋白的温度系数Q10＝1.8，而凝块形成反应的温度系数为Q10＝16。也就是说，温度每升高10℃凝乳反应的第一阶段的反应速度提高1.8倍，而第二阶段的反应速度提高16倍。温度影响酪蛋白胶束的聚集速度，温度升高酪蛋白胶束的表面电荷减少。当温度接近60℃时，酪蛋白胶束的表面电荷几乎为零，从而加快了酪蛋白胶束的聚集速度和胶束集合体之间的交联。这就是为什么凝乳酶被加热到65℃左右时，几十秒内表现出高凝乳活力的原因。但随时间的延长酶迅速变性，活力快速下降。试验证明，凝乳酶的活力在20～65℃之间，随温度的上升而升高，在65℃左右达到最高，但是很快失活。在干酪生产中，实际采用30～35℃、40min凝乳。过高的温度会引起β-乳球蛋白的变性，变性的β-乳球蛋白与k-酪蛋白结合导致凝块变软，另外，高温会抑制嗜温性乳酸菌的生长。但可以选用嗜热的乳酸菌作为发酵剂，适当提高凝乳温度，既可以缩短干酪生产的时间，又能提高凝块的硬度，保留更多的脂肪，从而提高干酪的产量。

（三）钙离子的影响

钙离子浓度的增加可以缩短凝乳时间，增加凝块的硬度。在k-酪蛋白的酶促水解阶段不需要钙离子的参与，但在乳中添加钙离子，通过钙离子与氢离子之间的交换而降低乳的pH，间接增加了酶促反应的速率。在胶束凝聚阶段，随着k-酪蛋白的进一步水解，由于钙离子的参与，钙离子与酪蛋白胶束中的胶体磷酸钙进行离子交换，使k-酪蛋白胶束的表面电荷进一步减少，胶束间的空间斥力减小，胶束彼此逐渐靠近，导致大量的胶束凝聚。由于Ca2＋结合到酪蛋白粒子上，或中和结合在酪蛋白粒子上基团的电荷或者形成凝胶体磷酸钙，在乳中适当添加Ca2＋，可以增加凝胶体的硬度。

在凝乳体系中，Ca2＋与凝胶体磷酸钙之间存在着平衡。当补加钙离子时，平衡向胶体磷酸钙一边移动，从而引起胶体磷酸钙浓度的升高，酪蛋白胶束聚集的速度加快，凝乳时间缩短。另外，Ca2＋能与酪蛋白结合，释放出质子，引起乳pH的降低，并使凝乳反应的速度加快。

（四）其他因素的影响

一般说来，底物浓度的增加能加快酶反应的速度。在干酪生产过程中原料乳经过超滤浓缩后，蛋白质浓度提高对凝乳时间有一定的影响。凝乳反应第一阶段，时间的缩短与乳中蛋白质的浓度呈指数关系，增加凝乳剂的浓度具有相同的作用。

某些金属盐类和螯合剂对凝乳剂的凝乳活力也有影响。研究发现，Na＋、Fe2＋和ED⁃TA对凝乳酶活力有促进作用，Mg2＋、Cu2＋、Ba2＋对凝乳酶有抑制作用，K＋对凝乳酶的活力无明显影响。降低pH、升高温度、增加凝乳剂浓度和提高钙离子浓度均能缩短凝乳时间。凝块的硬度随pH下降和钙离子的添加而提高，随温度的升高而降低。

三、主要的代用凝乳酶

凝乳酶按其来源可以分为动物凝乳酶、植物凝乳酶、微生物凝乳酶及遗传工程凝乳酶。大多数蛋白酶可以在适宜条件下使牛乳发生凝固，但它们并不都适用于制作干酪，因为它们不具有干酪生产所必需的生物化学特性和加工特性。适宜的凝乳酶一般都是酸性蛋白酶，目前国内外学者对凝乳酶的研究主要有以下几个方面：

（一）动物凝乳酶

动物凝乳酶中使用最广泛的是小牛皱胃酶。小牛皱胃酶具有较好的凝乳效果，干酪的硬度和弹性符合工艺要求，出品率较高，不产生苦味，因此小牛皱胃酶一直得到人们的青睐。

其他动物凝乳酶，主要是胃蛋白酶，其性质在很多方面与皱胃酶相似，作为皱胃酶的代用酶在干酪的生产中得到应用。但由于胃蛋白酶的蛋白分解力强，导致乳清中溶有较多的蛋白质，干酪得率很低，且由于干酪蛋白的过度水解，使干酪产生苦味等缺陷。

实验表明，猪的胃蛋白酶比牛的胃蛋白酶更接近皱胃酶，用它来制作契达干酪，其成品与皱胃酶制作的干酪相同。但是猪胃蛋白酶的稳定性较差，容易受热钝化，单独使用时，干酪凝块的残留活性低，在干酪成熟中对蛋白质降解贡献非常小，成熟很慢，并且组织状态较差。但当它与粗制皱胃酶混合使用时可收到很好的效果，所以猪胃蛋白酶可以部分替代皱胃酶。

（二）植物凝乳酶

许多植物中含有能使乳凝固的蛋白酶，如木瓜、无花果、菠萝、南瓜、甘薯等。植物蛋白酶分布于植株的大多数部位，如果实、叶、花、茎、根等部位均可分离得到蛋白酶。但是植物蛋白酶的蛋白分解活力过强，可使干酪产生苦味。还有一些植物非蛋白酶，如姜汁、柠檬汁等也有很好的凝乳作用，可以替代小牛皱胃酶，但其有效物质及其作用机制还有待于进一步研究。

（三）微生物凝乳酶

目前世界上一半以上的凝乳酶都是由微生物产生的，微生物凝乳酶可分为真菌、细菌、担子菌3种来源。微生物凝乳酶具有较多优点：微生物酶的生产不受量和原料供应的影响，可以保证酶的纯度，成本较低，不受法律宗教限制，可以应用在不允许使用其他凝乳酶（如印度）的地方。国际上，微生物凝乳酶主要是由米黑毛霉、微小毛霉和粟疫霉等生产的，其代表是微小毛霉凝乳酶。现在，日本、美国等在干酪生产中均有应用。

我国在20世纪80年代后期开始进行微生物凝乳酶的研究并已经进入商业化生产。用微生物凝乳酶生产干酪时，成熟干酪的感官特性与小牛皱胃酶生产的干酪接近，主要缺陷是蛋白质分解能力强，干酪得率低，产生苦味等。另外，微生物凝乳酶的耐热性高，给乳清的利用带来不便。

（四）遗传工程凝乳酶

由于皱胃酶的代用酶在干酪生产中表现出某些缺陷，迫使人们利用新的技术和途径寻求小牛以外的皱胃酶来源。遗传工程技术通过基因克隆诱导产生皱胃酶前体，得到了很好的应用。

小牛皱胃酶的基因已经被成功地克隆进大肠杆菌、马克斯克鲁维酵母乳酸变种、黑曲霉泡盛变种、糖酵母、雷氏木霉等的遗传物质中，表达后获得的凝乳酶称为重制凝乳酶。详细的生物化学分析表明，天然皱胃酶同工酶与基因重组的微生物酶完全相同，对不同酪蛋白的水解活力也完全相同，因此它们的使用已经得到相关法规的批准，在大多数干酪生产国已得到广泛应用。

基因工程酶的重组DNA技术在生产中的应用，使凝乳酶的短缺问题得到根本性的解决。在我国，这方面的研究也取得了较大的进步，但尚未进入产业化阶段。